ELISA 的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。

一、试剂的制备

ELISA 的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。

（一）固相载体

可作 ELISA 中载体的物质很多，常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在 ELISA 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。

ELISA 载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径 0.6 cm 的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。常用的载体为微量反应板，于 ELISA 测定的产品也称为 ELISA 板，通用的标准板形是 8×12 的 96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成 8 联或 12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的 ELISA 检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。

良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人 IgG（一般为 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人 IgG 抗人 IgG 抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在 0.8 左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于 10％。

与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。

为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的 ELISA 操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别大，这种载体就是这一 ELISA 测定的合适的固相载体。

除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在本章第五节「膜载体的酶免疫测定」中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。

（二）抗原和抗体

在 ELISA 实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。

ELISA 所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。

用于 ELISA 的抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂，应从中提取 IgG 才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的 IgG 可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性 IgG，如用酶消化 IgG 后提取的 Fab 片段，则效果更好。

（三）免疫吸附剂

固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（常用的为 pH9.6 的碳酸缓冲液）中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质*覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用 1％～5％ 牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的 ELISA 板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。

（四）酶和底物

ELISA 中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。ELISA 中常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。

HRP 在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约 18％；分子量为 44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在 275nm 波长处有吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在 403nm 波长处有吸收峰。

（五）结合物

酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。

1．戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接 AP），也可用二步法（如连接 HRP）。举例如下：

2～5 mg 纯抗体与 5 mgAP 混合于 0.1mol/LpH6.8 的磷酸缓冲液 1 ml 中，4℃ 下对同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下，缓慢加入 1％ 戊二醛 0.05 ml，在室温下放置 2 小时。在 4℃ 下对 0.05mol/LpH8.0Tris 缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。

辣根过氧化物酶可溶解于 50％ 饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用 50％ 饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。

戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。

制备 HRP 抗体结合物也可用二步法，即先将 HRP 与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在 pH9.5 缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法 10 倍左右。

2．过碘酸盐氧化法本法只用于 HRP 的交联。该酶含 18％ 碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。

按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响 ELISA 中后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便，但效果不如用 SephadexG-200 凝胶过滤的好。