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Western Blot 中如何选择内参抗体
更新时间:2018-09-03   点击次数:944次

Western Blot 即免疫印迹试验,可以利用 Western Blot 来比较在不同条件下,不同细胞组织中目的蛋白表达量的差异,属于定性,半定量试验。既然有差异性比较,参照物*。Western Blot 试验中的标准(表达量)参照物即内参,有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。内参一般选用管家基因表达的蛋白,它们在各个组织细胞中表达相对恒定,不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常,比如蛋白提取过程,转膜体系,显色体系等。

 

 

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作为成熟的内参运用到试验中,下面就大致介绍下如何选择内参:

样本来源

● 如果是哺乳动物的组织或细胞,主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 为代表;

● 如果是植物样本,主要以 actin、Rubisco 为代表。

目的蛋白定位

● 全细胞蛋白和细胞质:beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等;

● 细胞核蛋白: PCNA 等;

● 核膜蛋白:Lamin B1 等;

● 胞膜蛋白:Na(+)/K(+) ATPase 等。

 

 

目的蛋白分子量

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分别是 42kd,50kd,37kd,目的蛋白分子量能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上,才能分开目的蛋白和内参,写文章做图也更美观;

三大内参

beta Actin,肌动蛋白,细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin 作为内参是得到*的,针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞质内,表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内,beta Actin 的表达量就很少。

 

GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,几乎在所有组织细胞中都高水平表达,在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的,且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

 

beta Tubulin,微管蛋白,细胞骨架蛋白。作为内参抗体,beta Tubulin 表达通常不会发生改变,因此被广泛用于 Western Blot 内参,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

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