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pH 值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响
更新时间:2018-09-30   点击次数:866次

实验方法原理     酶的活性和稳定性易受环境pH 的影响。通常各种酶只在一定的pH 范围内才表现出活性,各种酶在特定条件下都有它各自的适pH。

温度对酶的作用具有双重影响,在较低的温度范围内,酶反应速度随温度升高而增大,但是超过一定温度后,反应速度反而下降。

抑制剂与酶的活性部位结合,改变了酶活性部位的结构或性质,引起酶活力下降。抑制剂与酶结合分为可逆与不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶是通过共价键结合,不能用透析等物理方法解除。

 



【方案举例】
 
实验方法 1:
 
1. 按下表配制12 种缓冲溶液(公用)。
 
将两种缓冲试剂混合后总体积均为10 ml,其溶液pH 值以酸度计测量值为准。
 
2. 准备二组各12 支试管, 组12 支试管每支都加入0.2 ml下表中相应的缓冲液, 然后加入一定量的蔗糖酶(此时的蔗糖酶只能用H2O 稀释, 酶的稀释倍数和加入量要选择适当,以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0 的光吸收值(A650) )。另一组12 支试管也是每支都加入0.2 ml下表中相应的缓冲液,但不再加酶而加入等量的去离子水,分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8 ml。
 
3.  所有的试管按一定时间间隔加入0.2 ml 蔗糖(0.2 mol/L)开始反应, 反应5 min后分别加入1.0 ml 0.2 mol/L NaOH 终止反应, 接着加入1 ml 二硝基水杨酸试剂, 用保鲜膜包住试管口并刺一小孔,在沸水浴中煮5  min,取出速冷,然后加入5.0 ml 水,摇匀测定A520。
 
4. 本实验再准备二支试管, 一支用水作空白对照; 另一支作葡萄糖标准管。
 
5. 画出不同pH 下蔗糖酶活性(μmol/ min)与pH 的关系曲线,注意画出pH 值相同, 而离子不同的两点, 观察不同离子对酶活性的影响。

实验方法2:
 
本实验要测定0~100 ℃之间不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。包括冰水浴的0 ℃、室温(约20 ℃)、沸水浴的100 ℃和不同的水浴温度:10 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃。
 
每个温度准备2支试管,一支加酶,测酶催化,1支不加,以乙酸缓冲液作为酸,测酸催化。

1. 确定酶的稀释倍数,试管中加入0.2 ml 0.2 mol/L,pH 4.9的乙酸缓冲液,0.2 ml稀释的酶,加水至0.8 ml,加入0.2 ml 0.2 mol/L的蔗糖开始计时,在室温下反应5 min分别加 入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH 终止反应,接着加入1 ml二硝基水杨酸试剂,用保鲜膜包住试管口并刺一小孔,在沸水浴中煮5 min,取出速冷,然后加入5.0 ml水,摇匀测定A520。

2. 测定上列各个温度下的反应速度,每次用2支试管,均加入0.2 ml乙酸缓冲液,一支加0.2 ml酶,另一支不加酶,均用水调至0.8  ml,放入水浴温度下使反应物平衡30 s,加入0.2 mol/L蔗糖0.2 ml,准确反应10 min,立即加入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH终止反应,按规定进行操作,测定各管A520值,记录每个水浴的准确温度。

3.酶催化的各管A520值均进行酸催化的校正。分别画出酶催化和酸催化的反应速度对温度的关系曲线和lnk-1/T的关系曲线,用二条lnk-1/T关系曲线的线性部分计算两种活化能。


实验方法 3 :
 
1. 判断可逆与不可逆抑制的实验可选做。

2. 不含抑制剂(脲)的实验,可用实验(七)的数据,但必须用同一稀释倍数的酶,也可以重做,注意酶浓度要大些。
 
 3. 含脲抑制剂的实验可参照表2设计实验方案。共做三种抑制剂浓度[I]的实验,即分别为加4 mol/L的脲0.10 ml、0.20 ml和0.30 ml(注意:此时要分别少加H2O 0.1 ml、0.2 ml和0.3 ml),仍为12支试管,每支试管都要加脲,第9、第10两管仍为校正酸水解。第11、第12标准管也要加脲,以消除脲对显色的影响。

4. 画出反应速度与底物浓度的关系图,和I/V-I/[S]关系图,计算Km、Vmax、KI和相应的表观值,讨论脲对蔗糖酶活性的影响。

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