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贴壁、悬浮、原代细胞感染专用Protocol及常见问题解答
发布时间:2018-10-15   点击次数:228次

慢病毒是当前热门的基因操作,其感染谱广,可有效地感染肿瘤细胞、神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而为基因功能的研究提供了更强有力的。然而仍有一部分细胞,尤其是原代细胞和悬浮细胞由于细胞特性,很难获得的感染效率。为了提高细胞的感染效率,我们常常选择多加病毒或使用Polybrene等助感染试剂,然而细胞状态却变差了,且增加感染效率并没有达到理解的效果,这是什么原因呢?


 


一、对慢病毒感染出现的问题进行原因分析

1. 细胞状态变差——细胞毒性

    杂质:病毒溶液中残留的杂质蛋白、内毒素及宿主细胞DNA等是造成细胞毒性的主要因素。特别对于某些外源刺激敏感的细胞来说,严重时将导致细胞死亡。这是病毒感染细胞后,状态差异的主要原因。
    过度感染:外源基因过度表达,会导致目的细胞本身正常新陈代谢失衡。这是有些细胞过感会死亡的主要原因。

2. 病毒加了不少,效果不理想,如何增加感染效率——了解影响慢病毒感染效率的因素

    细胞膜的流动性
    细胞膜表面受体的表达丰度
    病毒与细胞的接触面积和接触几率
    细胞膜与病毒外壳蛋白电荷的多少

 
二、如何有针对性地增加慢病毒感染效率

了解了影响细胞状态和感染效率的原因后,我们就可以有针对性的进行调整。吉凯基因从大量的文献及实际操作中总结了增加感染效率的方法,可根据不同的实验需求选择性的使用:
 
1.  使用高滴度高纯度的慢病毒,可以减少病毒中的杂质对细胞状态的影响:降低慢病毒对细胞的毒性
2.  调整细胞状态,感染时使用对数期的细胞:增加细胞膜的流动性
3.  降低感染时血清浓度,使用无血清/低血清的培养基:降低血清蛋白对病毒外壳蛋白的封闭
4.  离心法,感染时将细胞培养板密封,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养:增加慢病毒与细胞的接触几率,但对细胞有一定的机械损伤,仪器要求高
5.  感染时加入Rentronectin等纤粘蛋白:增加慢病毒与细胞接触几率,但会影响细胞的贴壁状态
6.  使用传统的助感染试剂,如Polybrene:中和细胞膜和病毒粒子之间的电荷排斥,但Polybrene本身就具有细胞毒性,部分细胞对Polybrene敏感,容易导致细胞状态变差、形态发生变化、甚至死亡。

三、特殊细胞慢病毒感染注意事项

1. 悬浮细胞
    对于悬浮细胞,可采用离心感染方法提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。
 
2. 极难感染的细胞
    对于极难感染的细胞,可采用多次感染的方法,即感染一次后,重新加入新鲜病毒再次感染,可显著提升感染效率。但需要注意调整两次感染间细胞状态。
 
3. 传代能力较差的原代细胞、非分裂细胞
    原代细胞:由于细胞增长缓慢,可以在接种时提高汇合度到50%~60%,确保在感染后4天时细胞汇合度达到90%~100%;
    非分裂细胞:如神经元细胞,接种后不再增殖,需要按照100%的汇合度进行接种。

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