我们知道流式实验中抗体标记的数量越多得到的信息就越详细和准确，以此同时，实验操作也变得更加复杂。多色流式实验中的补偿操作，一直以来都是流式使用者非常关心的问题。甚至有人认为，由于目前荧光染料的光谱普遍比较宽，可能会在相邻的多个通道都造成比较大的干扰，因此很难在流式上完成超过 18 色以上的实验。事实是否真是这样呢？恰巧哈佛医学院附属麻省总医院的 Dr. Ravi Mylvaganam 与我们分享了他在 6 激光 21 色的 CytoFLEX LX 上做的一个多色实验。我们一起来看看。

Dr. Ravi Mylvaganam 采用 20 个荧光抗体以及一个细胞死活染料组成 21 色的 panel，可同时检测多群记忆、效应 T 细胞，调节性 T 细胞，NK 细胞甚至是干细胞样 T 细胞等细胞亚群，详细的抗体和染料标记如下所示：

实验样本准备步骤：

1. 标记一个样本管，在管中添加 3 ?L 以下抗体：

1)    CD3 BUV395
2)    CD19 BUV496
3)    CD56 BUV737
4)    CD25 BV605
5)    CD95 BV650
6)    CD38 BV786
7)    CD16 PerCP
8)    CD4 PerCP-eFluor710
9)    CCR4 PE-TexasRed
10)    CCR7 PC7
11)    CD8 AF790

2. 添加 25 ?L Brilliant Stain Buffer，涡旋混匀 4 秒；然后加入 100 ?L 全血，再次涡旋混匀 4 秒后，在 37?C 下避光孵育 20 分钟

3. 在试管中添加 5 ?L 以下抗体：

1)    CD57 Pacific Blue
2)    CD45 Krome Orange
3)    CD45 RA FITC
4)    CCR6 PE
5)    CD14 PC5
6)    PD-1 (CD279) PC5.5
7)    CD27 APC
8)    CD127 APC-A700
9)    CD28 APC-A750

4. 涡旋混合试管 4 秒后室温避光孵育 20 分钟

5. 在管中添加 1 mL VersaLyse 裂解液，涡旋混合 2～3 秒，室温下避光孵育 15 分钟

6 样本 200 g 离心 5 分钟，弃去上清液

7. 在试管中添加 5 ?L IR Fixable 染料，涡旋混合 2～3 秒，室温下避光孵育 20 分钟

8. 添加 2 mL PBS 重悬细胞，200 g 离心处理试管 5 分钟，弃去上清液

9. 添加 0.9 ml PBS 和 0.1 ml IOTest3 固定液重悬细胞，可准备上机检测

10. 同时按照上述的孵育、离心操作制备单染管

实验结果如下

从实验结果图可以看出，这个 21 色方案的结果分群清晰，不论是常规的 CD3+CD4+Th 细胞还是含量较低的 Treg 或者干细胞样 T 细胞，都能很好的检测到，看来对于 CytoFLEX LX 而言，21 色实验也不是一个难题。如果您需要该方案详细的信息，可与我们联xi。

多色补偿问题的简化，与流式细胞仪技术的发展密切相关。遥想小编当年，那个流式细胞仪用完后还要用红布盖起来的年代，我刚开始接触的是一台 4 色的流式，当时 4 色实验就是「多色」实验了！那时没有离线补偿也没有自动补偿，流式也没做得那么频繁，调补偿是相当刺激的操作：先在 17 寸显示屏上画满所有通道两两对应的散点图，上样之后一定要眼疾手快反应迅速默念「横平竖直」，如果相关的门没圈好，或者看到补偿矩阵脑子蒙圈不知道调哪里，一着急就手足无措，经常一管单染管跑完补偿还没调好所以实验前师兄师姐往往要提醒「单染管多准备点样本」……