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如何做好磷酸钙-DNA共沉淀法实验?
发布时间:2018-12-20   点击次数:96次

在分子生物学中,磷酸钙沉淀法特指将外源DNA转入真核细胞的一种方法。将氯化钙、DNA和磷酸缓冲液混合,形成吸附DNA的不溶性羟磷灰石细微颗粒附着在细胞表面,通过胞饮进入细胞。此方法对于贴壁细胞转染 是常用并shou选的方法。


核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%~5%可以进入细胞核 中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。


下列是其实验步骤:
一、配液
1. 2×HBS:1.63g NaCl;1.19g Hepes;0.023g Na2PO4-2H2O;加水至100ml pH7.1过滤,4℃保存
2. 2mmol/L CaCl2 过滤除菌
3. TE:0.1mmol/L EDTA 、1mmol/L Tris-HCL,PH8.0
4. G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。
5. G418选择培养基:用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200~800mg/L
注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在10~14天内能杀死细胞50%以上的低浓度。


二、操作步骤[方法一]:
1.供体DNA制备:方法按DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。
2. 受体细胞的培养:研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2 培养,待细胞占50~70%瓶底面积时,用于转染试验。
3. DNA-磷酸钙沉淀物的制备
① 将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1~2mg/L的使用量)。
② 取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。
③ 然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞。


4. 转染受体细胞
①将处于对数生长期已占瓶底50~70%的受体细胞,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶)。
②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。
③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。
④更换新鲜培养基,继续培养24小时,诱导转染基因的表达。
⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。
⑥培养大约3~5天,对照细胞大部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基,每3~4天更换一次选择培养基。
⑦2周后对照细胞死亡,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行化和扩大培养,可建立转化细胞株,并做进一步鉴定。
本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞,这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性,这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”,也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的,可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的DNA导入受体细胞即可,其方法如下:


三、DNA转染[方法二]:
1. 配制磷酸转染液:NaCl 8.0g;Hepes 5.0g 用时现配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65;Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌,-20℃贮存备用;加温水至 1000mL
2. 按前面介绍的方法提取癌细胞DNA。
3. 取供体DNA50~100μg,加3M NaCl或醋酸钠,使终浓度至0.3M混匀。
4. 再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟,去上清。
5. 加入转染缓冲液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2 ,含终浓度为125mM,用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结),置室温下10~30分钟,待液体透明度降低,出现微浊兰色时,即可用于转染细胞。
6. 取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞,在转染前4小时,更换培养液(5ml/瓶)1次。
7. 转染:向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5~1mL/瓶,置37℃作用4~6小时。
8. 培养:弃去培养液,用15%甘油处理3分钟,无血清培养漂洗1次,接近汇合时血清用量降至5%,培养2~3周。
9. 检测:逐日观察,待出现“转化灶”后,分离,扩大培养建立转化细胞株。

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