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古朵生物:免疫组化的二抗有区别吗!怎么选择?
发布时间:2019-10-25   点击次数:48次

免疫组化大家基本上都做过,你知道有二抗,也应该知道免疫组化的原理就是一抗结合到目标蛋白,再有二抗来进行信号放大,大概是这样:

 

 

但是你知道二抗的信号放大实际上有多种方法……这就需要你进行二抗标记方法的选择,简单的二抗标记方法是直接法:

 

 

就是直接在二抗上标记酶,比如HRP,来进行显色,这样的二抗实际上很便宜,但是缺点就是灵敏度低,好多低丰度的蛋白,结合不上,免疫组化染出来的效果就不太好。

 

第二种方法,叫做PAP,比如二抗标记了HRP,他们就在孵育二抗后,再孵育一种能结合HRP的一抗,就像这样:

 

 

这种方法灵敏度是上去了,但是非特异性增高了,于是被主流淘汰了。

 

第三种方法被称为ABC法或者SABC法,主要是在二抗上标记生物素,孵育二抗后,加入亲和素以及标记了HRP的生物素,以这样的聚合方式,来进行信号的放大作用:

 

 

这种方法的优点是能够成倍提高灵敏度,但同时也会提高非特异性,于是就产生了第四种方法,LSAB法标记的二抗:

 

 

这种方法,直接在亲和素上加上HRP标记,灵敏度也很高,同时降低了SABC法的非特异性。而且,LSAB法在实验的时一般孵育时间短(通常就10分钟)。

 

但SABC法和LSAB法在实验过程中会需要进行内源生物素封闭,会麻烦一些。为了省去麻烦,就产生了第五种标记方法,也就是Polymer法,就是在二抗上标记聚合的HRP:

 

 

这样二抗的信号就得到了放大,灵敏度也提高了,但Polymer法、SABC法、LSAB法,都不能用于定量实验,只能用在IHC上。

 

那免疫荧光呢?免疫荧光主流是采用直接法、LSAB法,以及直接标记或者LSAB标记的三抗来进行信号放大的。总结一下,就是直接法的二抗便宜但是灵敏度差;PAP法基本已经淘汰,LSAB和SABC法的灵敏度高,但是贵,步骤多;Polymer法灵敏度高,步骤简单,但是贵。

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