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细菌蛋白质抽取的方法步骤 古朵新闻√
发布时间:2019-12-04   点击次数:141次

1.仪器用具:

(1)恒温震荡培养箱37℃;

(2)高速冷冻离心机及离心管(使用20,000 rpm离心陀);

(3)液态氮及冰筒;

(4)37℃水浴锅

使用高速离心机要注意: 离心机及离心陀的温度要预冷完全,相对位置的两只离心管要平衡好,离心陀转速绝对不能超过zui高速限;

2.药品试剂:

(1)转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落;

(2)LB/amp/kan 及IPTG (1 M stock);

(3)Lysis buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100)。使用前添加成:10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme;

(4)Buffer A(50 mM Na3PO4, pH 7.0) 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM zui终浓度;

(5)Buffer B: Buffer A 再加入0.15 M NaCl;

(6)硫酸铵 (要烘干并以研砵磨碎)。

3.方法步骤:

(1) 挑取培养皿上单一菌落,培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中,以120rpm 转速震荡,在37℃下培养过夜。

(2) 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中,以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后,加入IPTG成为1 mM浓度,继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。

(3) 将菌液倒入50 mL 离心管(conical tube)中离心10 min (5,000 rpm)。

(4) 倒去上清,可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。

(5) 取出含菌块的离心管置碎冰上,待菌块溶解后,以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。

(6) 将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次,尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。

(7) 离心20 min (12,000 rpm, 4℃) 取上清共 _____ mL,称为 粗抽取液 (XT);预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上,以低温进行实验。

(8) 此上清加入5 mL buffer A 混匀后倒入烧杯,置碎冰上放冷,不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度,加完后再搅拌10 min。

(9) 离心20 min(12,000 rpm, 4℃)后小心倒去上清,取白色沉淀部份。

(10) 沉淀加以2 mL buffer B均匀悬浊的,再以桌上型离心机去除不溶物质,(10,000 rpm,5 min),共得 ______ mL,称为 全蛋白质(TP);预留100 μL,连同上述XT 置4℃冷藏。

(11) 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析,标示清楚后置4℃冷藏。

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