免疫荧光染色是一种常用的一种生物化学检查方法，常用于组织学中抗原或抗体的定位，也可用于体液标本中抗原或抗体的定量检测。许多小伙伴，在做免疫荧光染色实验时，碰到各种各样的问题。事实上，掌握了免疫荧光染色实验的原理、操作步骤及注意事项，要成功完成一项免疫荧光染色实验并不难。

1、免疫荧光技术是什么?

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。免疫荧光技术既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。

免疫荧光染色实验有两种，包括直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。



免疫荧光法原理图

直接免疫荧光法是zui早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。

间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。

两种方法，基本原理是一样的。免疫荧光 (IF) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料（也称为荧光素或荧光物）标记到特异性目标抗原上，所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (FITC) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。

直接免疫荧光法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想。

间接免疫荧光法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。所以间接免疫荧光法geng加常用，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第1抗体的标记显示。

2、免疫荧光染色实验操作步骤

免疫荧光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤以及测定读数。本文以间接免疫荧光法为例，讲讲从固定到封片每个步骤的原理。

1）样品准备(Sample preparation)

对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。

对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。

对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

对于石蜡切片：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。

抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。

2）固定

目的是保留组织的原始结构，维持细胞形态和抗原的细胞分布。当组织细胞死亡时，细胞发生分解，从其溶酶体和其他细胞器中释放的酶，可以水解组织，这一过程称为自溶。为了避免这种情况，固定组织细胞很有必要。

可以使用适当的固定液固定细胞或切片，固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。常用的固定剂有甲醛，戊二醛，甲醇/丙酮。不同固定剂所需时间和浓度不一，需要根据具体实验进行探索。

3）破膜

破膜是为了让抗体能与抗原有机会相见。因为免疫染色的基本原理就是让抗原抗体相结合，然后标记的抗体通过发荧光，使得我们可以对目的蛋白进行定性或定量分析。如果要检测的抗原在细胞膜外表面或细胞外基质，那么可以省去破膜步骤。因为在不破膜的情况下，抗体也能有机会与抗原结合。但是，如果需要检测的抗原在细胞内，则需要破膜，将细胞暴露于针对目的蛋白的第1抗体，以确保抗体可进入表位。常用的破膜剂有Triton X-100, NP-40, Brij-58, 皂苷, 洋地黄皂苷, 甲醇/丙酮。同样，应根据具体实验进行破膜剂的选择。

4）封闭(Blocking)

封闭是使一抗的非特异性结合zui小化的重要步骤。在使用特异性的一抗与目的蛋白结合的过程中，如果有非特异性结合，则可能出现假阳性结果，较强的背景染色也会干扰目的染色的呈现，影响实验结果的判断。从理论上讲，任何不结合靶抗原的蛋白质都可以用于封闭。血清是一种常见的封闭剂，因为它含有与非特异性位点结合的抗体。用血清或蛋白质封闭剂封闭可防止抗体与组织或Fc受体非特异性结合。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

5）一抗孵育(Primary antibody incubation)

事先选择的特异性一抗可以与目的蛋白结合。这一步需要注意的是一抗是抗什么物种的。如果组织细胞来源是小鼠，则一抗应该是某种动物抗小鼠，这里的某种动物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。

6）二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

第1抗体孵育后，洗掉未结合的一抗抗体，便可以进行一抗与二抗的结合。二抗应该是针对第1抗体宿主物种的，荧光标记的第二抗体。例如，一抗是羊抗小鼠，二抗应该是某种动物抗羊，比如兔抗羊。

如果进行的是双染，就要注意一抗二抗宿主的选择，不要使其有交叉结合的可能。比如，组织来源是小鼠，有两个目的蛋白需要检测，一抗宿主应该要不一样，二抗应有不同荧光标记。针对A目的蛋白的一抗是羊抗小鼠，针对B目的蛋白的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和羊是不同一抗宿主），A二抗是带有绿色荧光的兔抗羊二抗，B二抗是带有红色荧光的兔抗大鼠二抗，这种搭配是可以的。在荧光显微镜下，A目的蛋白染成了绿色，B目的蛋白则染成了红色。但是，如果B一抗也是羊抗小鼠，则A二抗也会与B一抗结合，这时候就乱了，荧光镜下一片绿。

7）封片

封片是指免疫染色后，使用固定介质将盖玻片粘附到组织切片或细胞涂片上。封片可以保护已染色的标本，以免受到物理损害。进行封片的固定介质也有助于提高显微镜下图像的清晰度和对比度。

8）蛋白检测(Detection of proteins)

对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。



3、三种细胞免疫荧光染色实验操作举例

zo-1的免疫荧光

1）细胞在盖片上生长融合到95%-时，从孵箱中取出。

2） 用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟

3）4%的甲醛室温固定20-30分钟

4）1×PBS洗3次，每次10分钟

5） 0.2%Triton X-100透化2-5分钟

6）1×PBS洗3次，每次10分钟

7. 5%BSA室温封闭30分钟

8） 加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜

9）1×PBS洗3次，每次10分

10）加二抗（用1%BSA稀释）30分钟，闭光！!！

11）1×PBS洗3次，每次10分钟

12） 95%甘油封片

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释"

细胞爬片的免疫荧光

1）取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里，PBS洗三遍。

有的时候作的细胞爬片可能比较小，夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2） 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3）0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4） 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5）一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果hao，PBS洗三遍。

6）二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7）用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8）蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

细胞免疫荧光简单实验

1）漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.

2）-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟

3）PBS洗净:3min*3

4）1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5）PBS洗净:2*5min

6）羊血清封闭：37度，20分钟

7）一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时

8） 4度PBS洗净，3min*5次

9）二抗37度小于一小时

10） 37度PBS洗净，3*5min凉干封片(封闭液PH8.5)

不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。

4、免疫荧光染色操作注意事项

1）荧光试剂要放好

尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光，则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。因此，荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。

2）选择荧光要谨慎

免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，如今流式细胞仪能检测每个细胞中20多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的*性质，如zui大吸收波长和zui大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。

3）合适对照不可少

任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。每次试验时 ，需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

5、免疫荧光实验常见问题排除指南

1）背景染色太强

背景染色太强是指除了我们想看到的特异性染色在前台唱主角演戏，还有一堆吃瓜群众（与想看到的特异性染色颜色相同）在后面抢戏。

是什么原因导致这些戏精抢了主角的戏呢？可能的原因如下。

组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。

封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间

二抗有非特异性结合：要想验证是否如此，可以在染色过程中做个只加二抗的空白对照（也就是说不用特异性的一抗进行一抗的孵育过程，比如用一抗稀释液进行孵育一抗的步骤）. 如果空白对照有染色，说明二抗有非特异性结合，这时候建议geng换一种二抗。

自体荧光:想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

抗体浓度太高：降低所使用的抗体浓度或调整孵育时间。

洗涤不充分:染色有很多步骤，其中又包括很多洗涤的步骤。在实验过程中，确保洗涤到位，不要偷工减料。

2）染色较弱或没有染色

可能的原因如下：组织本身不存在你想研究的目的蛋白或者表达量很少。

如果怀疑目的蛋白并不存在，可以通过多种方式验证，比如WB。因为不同探究蛋白的实验的原理和操作会不一样，所以可能得到的结果会不一样，多种实验的验证geng有可能避免假阴性的出现。如果目的蛋白表达量很少，则可以考虑增加一个扩大荧光信号的步骤。

荧光显微镜的问题。

如果对荧光显微镜的参数设置不对，有可能导致看不到荧光。比如光源/滤光设备与你想检测的荧光不匹配。每次拍照，记得检查参数是否有误。

曝光时间太短或吸光太少（gain值太低）:可以尝试调大Gain值并/或增加曝光时间，找到*值。

曝光时间太长，出现荧光淬灭：避免让切片过度曝光。使用完立即将切片保存在黑暗处。

细胞/组织固定过度：因为过度固定可以让抗原表位带上面具，使得抗体无法与抗原结合，这样当然就没啥荧光啦。所以可以尝试减少固定的时间，也可以尝试做抗原修复以显现抗原表位。

组织/细胞干透:确保整个染色过程中，切片都处于潮湿环境。

细胞没有通透，一抗进不去:举例来说，如果你想研究的目的蛋白在细胞里面，但是抗体因为没有金刚钻，不能进入细胞里与目的蛋白长相厮守，那么你当然看不到它们的爱情闪光点。所以呢，可以想办法让细胞开通绿色通道，搭个鹊桥。比如，如果使用甲醛固定组织细胞，可以用0.2% Triton X-100（不同实验可能所需浓度不一）通透细胞。如果是用甲醇或者丙酮固定的组织细胞，则不需要使用Triton X-100，因为前者可以通透细胞。

一抗量不够/孵育时间太短:提高抗体的浓度或增加孵育时间

一抗不合适：购买一抗前，记得阅读产品信息，不是所有一抗都可以进行免疫荧光染色实验的。另外，确保产品没有过期。

一抗二抗不兼容：举例来说，如果你的组织来源是小鼠，那么一抗应该是某种动物抗小鼠，比如山羊抗小鼠，那么，此时二抗应该是某种动物抗山羊，比如兔抗山羊。也就是说，二抗应该是抗一抗宿主的。

切片储存时间过长：样品染色后应该尽快观察拍照，否则信号会随时间减弱。可以考虑将切片保存在 4?C 避光处，尽量延长储存时间。

抗体储存问题：避免反复冻融抗体，因为可能会引起抗体出现降解。建议买了抗体后，根据实验每次的需求，将抗体分成多个小份保存，这样每次使用一个小管即可。另外，储存前记得看说明书，根据说明书的指示进行保存。比如具体保存温度，是否要避光等。

小结：希望上面这些小贴士，能帮助大家成功完成免疫荧光染色实验