第1章 基因克隆

1. 操作流程

收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体

连接，取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴

定(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆

信息输入数据库——>质粒实物保存

2. 方法

2.1 设计引物

引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm

为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。

forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC

reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC

2.2 PCR

2.2.1 PCR 反应体系

模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl

4dNTP(10mM) 1.00μl

10×PCR Buffer 5.00μl

MgCl2(25mM) 5.00μl

5’Primer (10-12uM) 4.00μl

3’Primer (10-12uM) 4.00μl

5M 甜菜碱 10.00μl

Pfu (5U/ul) 0.50μl

ddH20 18.50μl

第1章 基因克隆

总计 50.00μl

2.2.2 PCR 反应程序

1)从cDNA 文库克隆基因

Stage1 Stage2 Stage3

1 Cycle 30Cycle 1 Cycle

95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

2min 30sec 30 sec

Xmin(2

min/Kb)

10min 1min

注：Pfu 酶zui适延伸温度为68℃。

2)从含目的基因质粒中克隆

Stage1 Stage2 Stage3

1 Cycle 22Cycle 1 Cycle

95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

2min 30sec 30 sec

Xmin(2

min/Kb)

10min 1min

2.3 割胶回收目的片段

(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)

1) 1%Agarose 胶电泳将目的DNA 片段用干净的手术刀割下，放入1.5ml 离心管

2) 称重后，在1.5ml 离心管中加入3 倍胶体积的buffer QG(100mg 加300ul)

3) 50℃水浴中放置10min(至胶*溶解)，每2-3 分钟混匀一次(溶胶液应于buffer QG 颜色相同)

4) 加入1 倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻。

5) 将样品转移入柱子中(柱子的zui大容量为800uL)，然后13000rpm*1min 离心

6) 取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中

第1章 基因克隆

7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室温放置2-5min，然后13000rpm*1min 离心

8) 取下柱子，弃流出液，再次13000rpm*1min 离心

9) 将柱子放置在一支新的1.5mL 离心管中，加入50uL EB buffer (或无菌H2O)至膜中央，静置片刻，然后13000rpm*1min 离心，然后测定浓度

2.4 连 接

在连接反应中通常要求： (目的基因分子数：载体分子数=3：1)

连接反应体系

sample + -

10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl

PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl

目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /

T4 连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl

补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl

于16℃连接过夜。或室温(25℃)1 小时以上。

2.5 感受态细胞制备及转化

2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、0 )

1） 接过夜菌 在15ml 试管中加入3ml LB 培养基，从平板上挑取一单克隆接种，37℃，260rpm，培养过夜，约16 小时。

2） 接菌 取2ml 过夜菌接入200ml 新鲜的LB 培养基， 37℃，260rpm，培养，直至OD600=0.4-0.5(一般约2 小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。

3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，弃上清。

4） CaCl2 悬浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴10min。

5）离心 4℃，5000rpm×5min，弃上清。

第1章 基因克隆

6）CaCl2 悬浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min 即感受态制备完成。

此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油，混匀后-80℃冻存，以后使用(一般可存1 个月)。

注： 制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。

2.5.2 转化(PGEM-T vector)

1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。

2) 取100ul 感受态细胞，加入5ul 连接液，冰浴45-60min。

3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)

4) 冰浴2min。

5) 加LB 培养基900ul，37℃，150rpm 培养45-60min。

6) 4000rpm×3min 离心。

7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的LB 板(预先涂

布X-gal 和IPTG)。

8) 37℃ 培养箱倒置培养过夜，约16 小时。

2.6 接菌

1） 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是PGEM-T 做连接，经X-gal处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。)

2） 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB 培养基。

3） 37℃，260rpm 培养。

4） 培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR 鉴定。

5） 以PCR 结果，将有目的片段插入的样品以5ml LB 培养基再次接菌，37℃，260rpm 培养过夜，约16 小时。

2.7 阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定)

2.7.1PCR 鉴定体系

第1章 基因克隆

10X Taq buffer 3 ul

4X dNTP (10mM) 0.5 ul

Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)

10uM引物 (双向) 各1ul

50%DMSO(which is optional) 1ul

模板：过夜菌液 / 挑单克隆 2ul

加灭菌水至 30ul

2.7.2 PCR 鉴定程序：

94℃ 5min

94℃ 30s

30cycle 55℃ 30s

72℃ 3min

72℃ 10min

4℃ +∞

30ul 上样，走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小2.8 质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)

1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)

2) 弃上清。

3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。

4) 加200ul Solution II，温和混匀6 次。(此过程不超过5min)

5) 加280ul Solution III，温和混匀6 次。

6) 以14000 rpm×10 min 离心。

7) 取上清，过吸附柱，以10000 rpm×1 min，弃滤液。

8) 吸附柱内加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。

9) 反复步骤8)一次。

第1章 基因克隆

10) 14000 rpm×1 min 离心。

11) 将吸附柱旋转180 度后再14000 rpm×1 min 离心。

12) 加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置2min。

13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒DNA。

2.9 测 序

1) ABI377 测序仪测序。

2) 测序结果分析：用软件Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。

3. 基因克隆的编码

根据实验基因引物的号码相对应编制。

如：基因引物编号： 1000_f 1000_r

克隆编号： 1000A1 or 100092

(注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…zui后一位为克隆数编号，一般为1—3)