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PCR扩增得率低或者无扩增?一篇干货解决所有问题
更新时间:2020-06-09   点击次数:600次

PCR实验时,我们有时候会遇到目的基因得率低,或者根本扩不出来的情况,不管是PCR的实验王zhe,还是初级实验小白,都需要逐个排查问题,那么我们需要考虑哪些因素呢?

今天这一篇干货,帮您*解决问题。

首先考虑的问题,是不是DNA模板的问题呢?

    如果模板质量太差?

那么检查DNA模板的纯度和完整度,保证你的模板中不含有PCR抑制剂。在分离DNA时,尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要,可通过凝胶电泳检测模板DNA完整性。

将DNA保存于分子级别的水或TE缓冲液 (pH 8.0)中,防止被核酸酶降解。

    如果是模板浓度太低?

建议使用DNA纯化试剂盒分离模板DNA时,应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南,改善较低的DNA质量。如果采用化学或酶促DNA纯化方案,应确保无PCR抑制剂残留,如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA,去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子(如, K+, Na+等)。选择具有高合成能力的DNA聚合酶,这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。

    如果是DNA模板量不足?

建议检查 DNA起始量 ,如有需要适当增加起始量。 选择具有高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。适当增加PCR循环数。

    如果需要扩增的目的片段比较复杂(如,高GC含量或含二级结构)?、

建议选择具有相应的扩增试剂盒,比如适合高GC含量片段的PCR试剂盒。或者选择具有高合成能力的DNA聚合酶,这类酶对DNA模板的亲和力较高,geng适合扩增困难靶标。 使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ,促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加 变性时间或温度 ,从而高效解离双链DNA模板。

    如果目的片段太长?

建议直接使用长片段设计的PCR试剂盒,或者确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶,这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度,增加延伸时间。

或者是引物的问题?

    考虑引物浓度是不是不是you的?

建议预实验优化引物浓度(范围通常为0.1–1 μM)。对于长片段PCR和使用简并引物的PCR,小起始浓度为 0.5μM。

    引物设计有问题?

可以使用多种引物设计软件比如Primer Premier等,或者使用在线 引物设计工具 。确保引物针对目的片段具有特异性。 确认引物与正确的目标DNA链互补。

也许是其他试剂的问题?

    MgCl2 浓度太低?

镁离子(Mg2+)作为DNA聚合酶活性的辅助因子,有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外, Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷,从而促进引物与DNA模板形成复合物。在PCR中,标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4 mM,建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性,导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面, Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性,产生非特异性PCR产物,并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。

还有可能是PCR循环设置不理想呢?

    变性效果不理想?

建议优化DN变性时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反,变性时间长、温度高可能会降低酶活性。

    退火效果不理想?

尽量使用 梯度热循环仪 ,以1–2°C增量逐步优化退火温度。jia退火温度通常比低引物Tm低 3–5°C。当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂 时,应调整退火温度。使用DNA聚合酶在其jia缓冲液中的 推荐退火温度 。DNA聚合酶不同,则引物对的退火温度也不同。

    延伸效果不理想?

选择适合于扩增子长度的延伸时间。

在扩增长片段(如,>10 kb)时,降低延伸温度(如,降至68°C)可保持酶活性。

使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶,在较短的延伸时间内也能实现 稳定的扩增 。

    PCR循环数不合适?

调整循环数(通常为23-35个循环),以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝,则将循环数增加至40。

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