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海藻及海洋细菌的DNA制备方法
更新时间:2021-11-02   点击次数:421次
  众suo周知,海藻由于富含多糖,DNA提取是一大难题,以下是在试验过程中收集的海藻DNA制备方法,经试验验证可行,现在贴出来,以觞众战友。
 
  一、可大量培养的海洋细菌
 
  1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中,5000r/m离心5分钟弃上清,菌体加入500μl水洗涤一次,5000r/m离心5分钟,弃上清,向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。
 
  2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS 45μl混匀,在微型蜗旋混和仪上混匀,55℃温浴15分钟,并且不断振荡混匀。
 
  3、12000r/m离心5分钟,取上层水相移至新的EP管中。
 
  4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提,12000r/m离心5分钟,转移上层水相至新管,反复抽提至界面澄清。
 
  5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。
 
  6、12000r/m离心20分钟,沉淀DNA弃上清,用预冷的的70%的乙醇洗2次,在室温下晾干,加入40μl无菌水溶解,-20℃保存。
 
  本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌(蓝藻)可行。
 
  二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合DNA
 
  海洋浮游生物生物量较小,往往需要采集大量的海水样本,过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因PCR扩增需要的浮游生物模板DNA制备方法。
 
  1、取40 μL水样,与等体积0.25 mol/L NaOH混合,并于25 ℃温育过夜。
 
  2、99 ℃加热10 min,冷却至室温,简单离心收集溶液,依次加入8 μL 1 mol/L HCl,20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)和10 μL 2% (v/v,体积分数)Triton X-100,混合并离心。
 
  3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。
 
  4、制备的模板DNA溶液pH值 在8到9之间,可直接用于PCR扩增反应,不需要其它纯化处理。
 
  本方法用于海洋弧菌可行。
 
  三、褐藻
 
  Approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% CTAB, 75mM Tris-HCl, 1.5mM EDTA, 1.0M NaCl, 0.5mg/ml RNase A), and incubated for 30 min at 65℃. Proteinase K (final concentration of 10 mg/ml) was added and incubation continued for 30 min at 37℃. An equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. Approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube and 50μl of 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. The upper aqueous layer was transferred to a new tube and an equal volume of 1% CTAB (10% CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA) was added, mixed and the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. The DNA was precipitated. The DNA was washed with 70% ethanol. Then the DNA pellet was air-dried and redissolved in TE (Tris-EDTA) buffer.
 
  本方法用于鼠尾藻,可行。
 
  四、红藻
 
  1、取1g藻体,用蒸馏水洗净,加入大约2ml提取缓冲液[4% SDS, 0.05 M Tris. HCl,pH8.0, 0.1M EDTA, 0.2MnaCl], 在0℃冰浴中充分研磨后,加蛋白酶K(终浓度100ug/ml),在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。
 
  2、15,000 rpm离心10min,取上清液,加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。
 
  3、取上清液,再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提,15,000rpm离心10min。
 
  4、取上清液,加入二倍体积的无水乙醇使DNA沉淀,离心,用70%的乙醇洗沉淀两次。
 
  5、干燥后,溶解在50ul无菌TE(10mMTris, 0.1mM EDTA,PH8.0)中,-20℃储存备用。
 
  本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。
 
  五、甲藻
 
  1、取对数生长期的培养物,在 4 ℃下用 冷冻离心机6000 rpm离心 6 min,收集藻细胞。
 
  2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后,在研钵中研磨成粉末,转移到 1.5mL 的灭菌离心管中,加入总体积 700μL 裂解缓冲液(100mM EDTA, pH 8.0;10 mM Tris-HCl, pH 8.0;1% SDS;200 μg/mL Protease K)放于55 ℃温浴 3 h,其间不时摇动。
 
  3、待溶液澄清透亮裂解*后,用一倍体积的平衡酚抽提一次, 吸取上清转移至另一灭菌管中; 上清用一倍体积的平衡酚:lv仿(25:24)抽提一次,吸取上清移至另一灭菌管中;上清再用一倍体积的平衡酚:lv仿:异戊醇(25:24:1)抽提一次,吸取收集上清;收集的上清液加入十分之一体积 3 M 醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇,-20 ℃过夜放置。
 
  4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清,DNA 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次,晾干。
 
  5、最终溶解于 50 μLTE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0;1 mM EDTA)。
 
  本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。
 
  六、蓝藻(以前在reply过,现在集中到这里)
 
  solution I: 100 mM NaCl, 30 mM Tris.Cl (pH 7.8), 10 mM EDTA
 
  solution II:0.1 M NaCl,0.2 M蔗糖,10 mM EDTA
 
  裂解液: 0.25 mM EDTA, 0.5 M Tris.Cl, (pH 9.2),2.5% SDS,10 mM ?-巯基乙醇
 
  TAE: 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA
 
  TE: 20 mmol/l Tris. Cl (8.0), 1 mmol/l EDTA (8.0)
 
  1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中;
 
  2、加入0.5 ml solution I,振荡1 min;
 
  3、 10,000 rpm离心1 min,弃上清;
 
  4、重新加入0.5 ml solution I洗涤,收集沉淀;
 
  5、用0.6 ml solution II悬浮沉淀后,加入0.2 ml 裂解液,剧烈振荡1 min;
 
  6、55 ?C水浴1 h;
 
  7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次(10,000 rpm, 8 min);
 
  8、用等体积的lv仿/异戊醇(10,000 rpm, 8 min)抽提1次后收集上清;
 
  9、 加入1/10体积的3 M NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇;
 
  10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min;
 
  11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干;
 
  12、50 ?l ddH2O溶解沉淀;
 
  13、 加入RNaseA去RNA,电泳检测后- 20 ?C保存备用。
 
  本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。
 

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