免疫亲和层析技术使用单克隆抗体或经过亲和层析纯化的多克隆抗体。在某些情况下，可用未纯化的多克隆抗体，但一般不使用混合的单克隆抗体。
 

       1. 应用多克隆抗体进行免疫亲和层析

 

　　使用多克隆抗体进行免疫亲和层析有一定的局限性，因为多克隆抗体通常结合抗原分子上的多个表位，虽然亲合力高，但洗脱困难。当一种抗原与多种不同的抗体结合后，需要很苛刻的洗脱条件，通常会损坏抗体层析柱，至少也会使部分抗原变性。在这种情况下，每种抗原和抗体相互作用的洗脱条件不同，故难以建立有效的洗脱条件。应用多克隆抗体的另一缺点是其中含有大量针对无关抗原的抗体。
 

　　两种类型的多克隆抗体可以用于免疫亲和层析柱，即针对合成肽或某种抗原中特定区域的抗体。在这两种情况下，由于结合到层析柱上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可能实现有效的洗脱。
 

　　如果要将多抗用于免疫亲和层析，一种方法是利用抗原亲和层析柱来纯化特异性的抗体。这种方法要求能得到足够量的抗原供制备亲和层析柱。另一种方法是利用针对某一物种蛋白的抗体，来纯化其他物种的同源蛋白。用抗原亲和层析柱来纯化多克隆抗体时，只需收集与抗原结合的抗体，因为是从抗原上洗脱下来的，从免疫亲和层析柱上洗脱抗原的条件已经确定，故不存在问题。
 

　　2. 应用单克隆抗体进行免疫亲和层析
 

　　应用单克隆抗体进行免疫亲和层析具有许多优点。单克隆抗体的来源不受限制，而且高亲和力的单克隆抗体可以结合抗原的容量大，因为所有的抗体都是均质的，并结合相同的表位，所有结合的抗原可以在相同的条件下被洗脱。由于单克隆抗体结合的是抗原分子上的单一表位，抗原-抗体之间的结合键基本上是均质的，洗脱抗原的条件也比使用多克隆抗体容易掌握。
 

　　应用单克隆抗体进行免疫亲和层析时出现的问题，通常涉及抗原的特性，低亲和力或交叉反应，低亲和力通常是免疫亲和层析法存在的共同问题。使用单克隆抗体时，交叉反应并不常见，主要出现在某些抗体的亚类上，由于抗体与其他抗原上的相同表位结合所致。这些表位可能有广泛的同源性，这种性质单克隆抗体可用于这些相关蛋白的研究，而不能用于抗原的纯化。另一方面，交叉反应可能只限于表位本身。在这种情况下，使用针对该抗原中其他表位的单抗能够消除交叉反应。另一个解决办法就是采用其他层析或抽提技术从杂蛋白中纯化抗原。
 

　　3. 用混合的单克隆抗体进行免疫亲和层析
 

　　除特殊情况外，一般不应将混合单抗用于制备免疫亲和层析柱。使用单克抗体混合物所遇到的与洗脱有关的各种问题已在上面提到。混合单抗通常仅用于纯化那些在使用之前需要经过变性的抗原，或制备抗原-抗体-微珠复合物用于免疫动物。