凝胶过滤层析又称凝胶排阻色谱, 分子筛色谱法, 凝胶过滤法等。利用凝胶过滤介质为固定相，根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。只依据尺寸大小分离，大组分最先被洗提出。色谱固定相是多孔性凝胶，只有直径小于孔径的组分可以进入凝胶孔道。大组分不能进入凝胶孔洞而被排阻，只能沿着凝胶粒子之间的空隙通过，因而最大的组分最先被洗提出来。小组分可进入大部分凝胶孔洞，在色谱柱中滞留时间长，会更慢被洗提出来。溶剂分子因体积最小，可进入所有凝胶孔洞，因而是最后从色谱柱中洗提出。这也是与其他色谱法最大的不同。
 

       凝胶过滤层析常见问题解答：

 

　　1. 色谱峰对称性差
 

　　出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。装柱前要了解填料的压缩系数(压缩因子)如Focurose FF系列的填料的压缩系数是1.15，且装完后要测柱效。
 

　　2. 柱床有裂缝或干涸等塌柱现象
 

　　检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重现装柱。
 

　　3. 分离度差
 

　　(1) 样品和选择的填料不匹配
 

　　待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限之外或者之内。若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时，建议尝试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择最接-近(大或小都可以)目标分子排阻极限的填料进行分离。
 

　　(2) 柱床装填的效果差
 

　　通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。
 

　　(3) 上样量过大
 

　　根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。
 

　　(4) 流速过快
 

　　凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。
 

　　(5) 层析填料被污染或老化
 

　　随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化(如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等)，导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
 

　　(6) 样品自身的问题
 

　　样品粘度过大也会导致分离度下降，粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理在凝胶过滤；
 

　　样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力，此时就要尝试添加一些添加剂(如2%的Triton x-100,150mM NaCl等)，减少样品中各组份之间的作用力；
 

　　样品的pH，离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响，也会影响分离度，必要时可以优化样品的缓冲液。
 

　　4、反压大，液流慢
 

　　凝胶过滤层析柱的装填应控制在60-100cm，太低影响分离度，太高反压增大。另外填料的清洁程度及样品的粘度，pH，离子强度也会影响液流速度。