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免疫定量分析中标准品的制备
更新时间:2022-05-23   点击次数:284次

标准品是标记免疫分析定量的依据。标准品的正确与否直接影响样品的测定结果。如果在连续测定中,或各实验室之间使用的标准品不一致,则可影响到实验结果的可比性。为此,对标记免疫分析所使用的标准品应满足如下要求。


一、标准品的要求

1、化学结构:原则上标准品应与被测物具有*相同的化学结构,包括相同的立体化学结构。但在实际工作中,用化学结构*相同的物质作标准品是十分困难的。这是由于一方面来源有限,另一方面有些被测物本身的化学结构还不清楚,或是有明显的异型性。所以有时也用结构类似的物质作标准品。此时,应充分了解这些物质与真正标准品之间的定量关系。

2、化学纯度:所有通过化学合成法制备的小分子化合物,都应是高化学纯度的纯品。对某些蛋白类物质,则可能由于纯化的方法不同而有差异。对此,在最初建立该方法时,应与国际上-*的标准参考品或高纯度的纯品进行比对。

3、免疫纯度:标记免疫分析是通过比较被测物质与标准品的免疫活性实现的,故被测物质与标准品对所用抗体的免疫活性应该*一致,即两者对所用的同一抗体有*相同的亲和力。因此,标准品的免疫纯度比其化学纯度更重要。

4、反应介质:免疫学反应受反应介质和温度等条件的影响,所以理论上要求标准品和被测物应在*相同的介质中进行反应。如测定血清中某物质的浓度,其所用的标准品也应溶解在无被测物的零值血清中;如测定尿液中某物质的浓度,其所用的标准品也应溶解在无被测物的尿液中等。但在实际工作中这一点很难做到。因为,血清中的成分十分复杂,因而无被测物的零值血清的制备非常困难,而且个体血清中还可能存在一些干扰物质。理想的标准品应该用与被测样品相同的基质(如血清),先将被测物质*去除,然后再加入已知量的被测物质的纯品。

5、干扰物质:标准品中不能有干扰分析的物质。在作为标准品使用前,必须对那些从机体提取到的大分子物质活性进行测定。

6、标准品的批量:为保证检测的连续可比性,每批标准品应有相当大的量,以保证在较长的时间内使用。每批标准品如保存的条件适当,在相当长的时间内可保持其浓度和免疫活性的稳定。这对于生产标记免疫分析试剂的厂家尤为重要。

二、标准品的分级

所谓标准品在英语中有三个名词,即标准品 (standard)、校准品(calibrator)和参考品(reference)。这三个名词的意义不*相同,但在国内它们则经常被混淆。目前在我国的标记免疫分析实践中,所谓的"标准品"实际上是指校准品。为使用方便先仍用"标准品一词"。


三、标准品的制备、鉴定、与计量

1、标准品的制备:标准品的制备是非常复杂的问题,也是标记免疫分析中比较难于制备的一个成分。以下讨论的是实验室标准品(或商品化试剂中标准品)的制备。

(1)基质的制备:如前所述,作为标准品的介质(基质)成分应与被测样品相同。对大多数用于测定血清中某物质的标准品,应用不含被测物质的零血清制备,以求反应的介质环境相当。但有时零值血清的制备十分困难,所以有些标准品用适当的缓冲液制备,并在缓冲液中加入一定量的载体蛋白(一般用1%~2%的牛血清白蛋白),以便使其与样品的介质环境相近。

零值血清的制备方法有:

A、吸附法:血清中小分子物质如三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素(T4)等,可用活性炭吸附去除。这种方法简便,但待测物质难以清除干净,而且大分子活性物质不能用此法进行制备。

B、反复冻融法:对大分子活性物质可选用低值血清,经反复冻融使被测物质失活。用这种方法可使某些蛋白类激素大部分失活,但也难以得到真正的零值血清。

C、亲和层析法:用特异性抗体制备亲和层析柱,用以吸附被测抗原。用这种方法可以得到高质量的零值血清,但本法比较复杂而且成本也高。

(2)标准物纯品的选择:应选择高化学纯和高免疫纯的纯品作标准品。其中免疫纯尤为重要,在标准品中不应含有与被测物质有交叉反应的物质。

(3)标准品的制备:先用零值血清配置高浓度的标准品,然后根据实验系统的要求,用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度,制成符合预定要求的,由不同浓度组成的系列标准品。

2、标准品的鉴定

(1)免疫活性的鉴定:选用高特异性的抗血清分别作*标准品(如WHO的国际参考品或国家标准品)的待鉴定标准品的剂量反应曲线,并观察两条曲线的平行性。如两条剂量反应曲线平行,说明两种物质对同一抗体有相同的亲和力,即二者是同质性物质。如两条剂量反应曲线不平行,说明两种物质具有异质性,因而这一待鉴定的标准品是不能使用的。

(2)浓度的标定:用已鉴定过的,免疫活性合格的标准品,与*的标准品作浓度相同的剂量反应曲线。此时,两条剂量反应曲线应该是基本重合的。如果两者平行但不重合,则取两条剂量反应曲线的50%结合处的相应剂量( ED50 )计算二者的换算系数,然后调整待鉴定标准品的浓度,直至使两条剂量反应曲线*或基本重合为止。

3、标准品的计量:许多小分子抗原或半抗原已能得到纯品或进行合成,它们对作为标准品的要求可以得到基本的满足,其计量多直接用单位体积中的重量表示,如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推荐用质量单位取代重量单位,即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。对大分子的活性物质则比较复杂。由于得不到绝对的纯品,故很难直接用单位体积中的重量或单位体积中的质量计量。因此,常用该物质的生物活性单位表示,如IU / L、mIU / L等。

四、标准品的稳定性与保存

如前所述,为保证检测的连续可比性,每批标准品应有相当大的量,以保证能在较长时间内使用。因此,每批标准品应在适当的条件下保存,使其免疫活性和浓度保持稳定。

1、影响标准品稳定的因素

(1)基质中的酶、细菌污染、pH的变化、氧化、潮湿等因素都可以导致标准品的变性,而且这些变化可因高温和光照加速。

(2)在保存过程中发生聚合反应等分子结构的变化,可使标准品失活。

(3)容器内壁的吸附作用和溶剂的蒸发可造成标准品浓度的改变。

(4)保存条件不适当也可以影响标准品的稳定性,如反复的冻融可降低标准品的免疫活性等。

2、标准品的保存方法

(1)冷冻干燥法:冷冻干燥对标准品的浓度和免疫活性无明显的影响,是目前常用的保存方法。冷冻干燥制品在低温下,可在较长的时间内保持稳定。但应用冷冻干燥制品时,复溶体积的准确度十分重要。因此,要用经过校准的量器准确的复溶,以减少标准品的浓度误差。

(2)在标准品中加一定量的防腐剂可减少细菌污染的影响。

(3)密闭真空保存或充入惰性气体等方法也可以增加标准品的稳定性。 目前常用的方法是:在标准品中加入少量的防腐剂(如0.1%叠氮钠或0.1%硫柳汞),冷冻干燥后密封,并在低温下保存。但应注意,一旦复溶后应放低温保存,并不得反复冻溶。复溶后的标准品其有效期明显缩短,一般不超过6~8周,有些物质可能更短。


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