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过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒(钼酸铵比色法)说明书
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理:
过氧化氢能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键,分子间立即脱水缩合,得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm处有强烈吸收峰,其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。
组成:
产品名称 | SR009-100T/96S | Storage |
提取液:酸性提取液 | 100ml | 4℃ |
试剂一:液体 | 15ml | 4℃避光 |
试剂二:液体 | 25ml | 常温 |
试剂三:液体 | 60ml | 4℃ |
说明书 | 一份 |
自备仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 酶标仪预热30min以上,调节波长至405 nm。
2、在EP管中加入下列试剂
试剂名称(μl) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 10 | |
试剂一 | 60 | |
混匀,25℃准确反应2 min | ||
试剂二 | 200 | |
试剂三 | 530 | 530 |
试剂二 | 200 | |
提取液 | 10 | |
试剂一 | 60 | |
混匀,取200μl于96孔板立即测定A空白和A测定,ΔA=A空白-A测定。空白管只需做一管。 |
CAT活性计算:
1、标准曲线:y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1 x:体系中过氧化氢浓度变化值(μmol/ml)
y:吸光值差值ΔA
2、血清(浆)CAT活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol /min/ml)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V样÷T=444.44×(ΔA-0.0013)
3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V样×Cpr) ÷T =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷(W× V样÷V样总)÷T=444.44×(ΔA-0.0013)÷W
V反总:反应体系总体积,0.8 ml;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml。
过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒(钼酸铵比色法)说明书
注意事项
1、 预实验若发现酶活性过高(A测定<0.1),可用提取液适当稀释样品后测定,并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、 若A空白<A测定,一方面可能是酶活性过低,可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重,可将样本稀释5倍左右后测定,并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。
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