蛋白质相互作用实验方法@古朵技术资料

　　免疫共沉淀和亲和层析共分离：

　　免疫共沉淀是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接经典和有效的方法，如蛋白A能与B相互作用结合成异源二聚体，无论用抗A或抗B的抗体或与A或B的亲和物偶联的agarose小珠都能把A和B沉淀下来。因此广泛用于蛋白质相互作用研究。

　　常用的小珠：

　　GST-Agarose(不需要抗体)

　　ProteinA-Agarose(用时需加抗体)

　　基本方法：

　　1.表达蛋白质A

　　2.蛋白质A与亲和小珠结合

　　3.用结合有蛋白质A的亲和小珠调取细胞破碎液中蛋白质B

　　4.离心、洗涤亲和小珠若干次

　　5.处理亲和小珠使蛋白质A、B解吸附(可以直接用SDS-PAGE上样BUFFER煮)

　　酵母双杂交系统

　　基本原理，以酵母S.cerevisiae的转录因子GAL4系统为例

　　GAL4有两个结构上互相分开，功能上相互独立的结构域。

　　N 端1-147aa与DNA结合(DNA binding domain,BD)。

　　C端768-881aa能激活转录(Activation Domain,AD)。

　　BD+AD—能激活GAL4效应基因的上游激活序列(UAS)。

　　把N和C分开分别构建成两种表达质粒。如把Gal4的N端和诱饵蛋白(研究的目标蛋白A)融合表达，把细胞cDNA和C端融合表达，cDNA编码的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端联系在一起，就可以激活UAS下游的基因表达。

　　半乳糖苷酶(Laz)基因克隆到URA3的下游。

　　在x-Gal的存在下酵母菌落成蓝色(Fields)

　　酵母GAL4基因缺失;GAL80基因缺失(GAL4的负调控因子)

　　方法略

　　假阳性多，因此还必须再用免疫共沉淀等直接证据证明

　　发展：哺乳动物双杂交系统、二倍体双杂交系统、酵母单杂交系统、细菌双杂交系统、酵母三杂交系统

　　FAR WESTERN

　　Western blot 是免疫印记，而Far western 是蛋白质铺盖技术，两者其实在本质上是相似的，只是免疫印记是直接用抗体去检测抗原，常用于蛋白质定性;而Far western则是用标记的蛋白(125I或荧光)去probe与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。

　　基本步骤：

　　1.表达和提纯获得蛋白A，并作荧光或放射性标记，或制备抗A抗体

　　2.细胞总蛋白SDS-PAGE(一起染色，另一块转膜)

　　3.电转膜

　　4.封闭

　　5.加入蛋白A，如A带标记，洗膜后直接显影;如未标记，可加抗A抗体再加二抗或标记的蛋白A。

　　优点：简单、经济

　　缺点：SDS-PAGE影响蛋白质构象，可能影响相互作用

　　蛋白质相互作用实验方法 上海古朵生物科技有限公司，由具有资深行业背景和丰富市场经验的专业人士组成，致力于为生命科学研究领域提供产品，为广大科研工作者提供服务。既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。产品涵盖有机试剂、无机试剂和生化试剂，标准物质、天然植物提取物及中药标准品，核酸、酶、缓冲剂、显色底物，医药中间体、原料药、催化剂、高纯溶剂、特种高分子材料及实验室常用耗材。品种类超过2万种，广泛应用于细胞药理、药剂、分子生物学等科研领域。