PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!

　　古朵 PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些-好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。

　　但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：

　　问题一：无扩增产物

　　现象：正对照有条带，而样品则无。

　　原因：

　　1、模板:含有抑制物，含量低。

　　2、Buffer对样品不合适。

　　3、引物设计不当或者发生降解。

　　4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。

　　对策：

　　1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。

　　2、更换Buffer或调整浓度。

　　3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物。

　　4、降低退火温度、延长延伸时间。

　　问题二：非特异性扩增

　　现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带。

　　原因：

　　1、引物特异性差。

　　2、模板或引物浓度过高。

　　3、酶量过多。

　　4、Mg2+浓度偏高。

　　5、退火温度偏低。

　　6、循环次数过多。

　　对策：

　　1、重新设计引物或者使用巢式PCR。

　　2、适当降低模板或引物浓度。

　　3、适当减少酶量。

　　4、降低镁离子浓度。

　　5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。

　　6、减少循环次数。

　　问题三：拖尾

　　现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

　　原因：

　　1、模板不纯。

　　2、Buffer不合适。

　　3、退火温度偏低。

　　4、酶量过多。

　　5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。

　　6、循环次数过多。

　　对策：

　　1、纯化模板。

　　2、更换Buffer。

　　3、适当提高退火温度。

　　4、适量用酶。

　　5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。

　　6、减少循环次数。

　　问题四：假阳性

　　现象：空白对照出现目的扩增产物。

　　原因：

　　靶序列或扩增产物的交叉污染。

　　对策：

　　1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

　　2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

　　3、各种试剂-好先进行分装，然后低温贮存。

　　PCR实验 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。