半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

　　RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

　　RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在*条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

　　实验步骤：

　　Trizol法RNA提取步骤

　　1、提取总RNA

　　2、逆转录反应

　　3、PCR反应

　　以下实验步骤仅供参考：

　　1 样品RNA的抽提

　　①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。

　　②两相分离

　　每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lv仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lv仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

　　③RNA沉淀

　　将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm

　　离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

　　④RNA清洗

　　移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

　　⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

　　⑥溶解RNA沉淀

　　溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

　　2 RNA质量检测

　　1)紫外吸收法测定

　　先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液

　　浓度和纯度。

　　① 浓度测定

　　A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40

　　μg/ml。具体计算如下：

　　RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21

　　RNA 浓度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：

　　35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg

　　②纯度检测

　　RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

　　2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

　　①制胶

　　1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲quan溶液(12.3

　　M)。

　　10×MOPS电泳缓冲液

　　浓度 成分

　　0.4M MOPS，pH 7.0

　　0.1M 乙酸钠

　　0.01M EDTA

　　灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25

　　μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

　　②准备RNA样品

　　取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

　　③电泳

　　上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

　　④紫外透射光下观察并拍照

　　28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

　　3样品cDNA合成

　　①反应体系

　　序号 反应物 剂量

　　1 逆转录buffer 2μl

　　2 上游引物 0.2μl

　　3 下游引物 0.2μl

　　4 dNTP 0.1μl

　　5 逆转录酶MMLV 0.5μl

　　6 DEPC水 5μl

　　7 RNA模版 2μl

　　8 总体积 10μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②混合液在加入逆转录酶MMLV

　　之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

　　③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

　　4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR

　　①β-actin阳性模板的标准梯度制备

　　阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

　　②反应体系如下：

　　标准品反应体系

　　序号 反应物 剂量

　　1 SYBR Green 1 染料 10μl

　　2 阳性模板上游引物F 0.5μl

　　3 阳性模板下游引物R 0.5μl

　　4 dNTP 0.5μl

　　5 Taq酶 1μl

　　6 阳性模板DNA 5μl

　　7 ddH2O 32.5μl

　　8 总体积 50μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　管家基因反应体系：

　　序号 反应物 剂量

　　1 SYBR Green 1 染料 10μl

　　2 内参照上游引物F 0.5μl

　　3 内参照下游引物R 0.5μl

　　4 dNTP 0.5μl

　　5 Taq酶 1μl

　　6 待测样品cDNA 5μl

　　7 ddH2O 32.5μl

　　8 总体积 50μl

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

　　5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

　　①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

　　反应体系：

　　序号 反应物 剂量

　　1 10×PCR缓冲液 2.5 ul

　　2 MgCl2溶液 1.5 ul

　　3 上游引物F 0.5ul

　　4 下游引物R 0.5ul

　　5 dNTP混合液 3ul

　　6 Taq聚合酶 1ul

　　7 cDNA 1ul

　　8 加水至总体积为 25ul

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72oC延伸5分钟。

　　②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

　　③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释:

　　设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

　　6 待测样品的待测基因实时定量PCR

　　①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

　　体系配置如下：序号 反应物 剂量

　　1 SYBR Green 1 染料 10 ul

　　2 上游引物 1ul

　　3 下游引物 1ul

　　4 dNTP 1ul

　　5 Taq聚合酶 2ul

　　6 待测样品cDNA 5ul

　　7 ddH2O 30ul

　　8 总体积 50ul

　　轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

　　②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃

　　1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表

　　引物设计软件：Primer Premier

　　5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

　　上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。