古朵技术分享：单克隆抗体制备实验注意问题

　　由于制备单克隆抗体的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：

　　1、污染

　　包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是单克隆抗体制备工作中zui辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

　　2、融合后杂交瘤不生长

　　在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：

　　(1)牛血清的质量太差，用前没有进行严格筛选;

　　(2)HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足;

　　(3)骨髓瘤细胞污染了支原体;

　　(4)EG有毒性或作用时间过长。

　　3、杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。之前提出的“三要"“三不要"，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要：

　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

　　要定期进行再克隆。

　　三不要：

　　不要让细胞“过度生长"。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　4、杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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