革兰阳性菌裂解缓冲液操作步骤及用途说明

　　革兰阳性菌裂解缓冲液说明：

　　分离纯化完整的RNA对于分子生物学的下游实验极其重要，也是进行基因表达分析的基础。从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中提取RNA的方法需要蛋白酶消化和有机溶剂抽提去除蛋白质，核酸消化去除DNA。革兰阳性菌裂解缓冲液主要由Tris-HCl、氯化钠、SDS等组成，临用前加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml。

　　革兰阳性菌裂解缓冲液操作步骤：

　　1、 取适量的革兰阳性菌裂解缓冲液，加入蛋白酶K，待用。

　　2、 取10ml培养物，离心，弃上清。

　　3、 重悬菌体于含有蛋白酶K的革兰阳性菌裂解缓冲液，在干冰或其他低温中冻结。

　　4、 解冻并超声30W 3次，温育。

　　5、 进行酚氯FANG异戊醇等方法抽提。

　　革兰阳性菌裂解缓冲液用途：

　　1.裂解都用到缓冲剂,只要在缓冲溶液pH范围内,BPS、Tris都可以作为缓冲剂,氯化钠的浓度直接影响到蛋白与蛋白之间的相互作用,一般浓度在0-1M之间。一般而言,氯化钠浓度越高,越不利于蛋白之间结合。EDTA浓度一般在0-5mM,也是缓冲剂的主要成分,也是酶活性抑止剂,量大可使酶失活保护蛋白。表面活性剂是非常值得关注的,离子性表面活性剂的裂解效果zui强,两性非离子性表面活性剂裂解效果次之。一般离子性表面活性剂的用量在0.01%-0.05%之间,两性表面活性剂用量在0-10mM之间,非离子性表面活性剂用量在0.1%-0.2%之间。在裂解液中常用到表面活性剂有Tritonx-100、NP-40、脱氧胆酸钠、肌氨酸钠、SDS、CTAB等。

　　2.裂解液中还有一个很重要的成分——蛋白酶抑止剂,其作用是阻止蛋白酶对细胞组织的消化作用,使组织细胞受到*的保护。不同的蛋白酶需要不同的抑止剂,对其选择相当重要,只有正确选择,才能有效抑止蛋白的降解,使其维持原有的蛋白相互作用。

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