ELISA法检测中应注意的哪些问题?

　　ELISA法特异性强 ,敏感性高 ,操作快速简便 ,因而是免疫学检验中zui为常用的方法 ,也是我们基层医院检验科免疫学检验的主要技术手段。我科乙肝五项、丙肝抗体、HIV抗体、梅毒抗体等均用ELISA法检测。其中HBsAg的检测量zui大。我们在实际工作中体会到ELISA法检测的全程质量控制很重要 ,的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。现将我们平时在操作中认为需要重视的步骤及遇到的一些问题报告如下 :

　　1 标本的采集和保存

　　一般在医学免疫检验中均以血清作为检测标本。血清标本可按常规方法采集 ,应注意避免溶血 ,因红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质 ,以HRP为标记的 ELISA测定中 ,溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染 ,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。标本储存时间过长,IgG可聚合成多聚体 ,在间接ELISA测定中导致本底过深 ,甚至造成假阳性。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过1周测定的需低温冰存。

　　2 试剂的准备

　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水 ,包括用于洗涤的 ,应为新鲜的和高质量的。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

　　3 加样

　　在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在ELEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部 ,并注意不可溅出 ,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器 ,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染。需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本 ,然后在微型震荡器上震荡1min以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器 ,使加液过程迅速完成。

　　4 保温

　　在ELISA中一般有两次抗原抗体反应 ,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间。ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会 ,只有zui贴近孔壁的一层溶液中抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标·记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育ELISA法一般均采用37℃水浴,可将ELISA板底置于水浴箱中,使温度迅速平衡。为避免蒸发,一定要用封板条封住反应孔。若用保温箱, ELISA板应放在湿盒内,在盒底垫湿的纱布,zui后将ELISA板放在湿纱布上。无论是水浴还是湿盒温育 ,反应板均不宜叠放 ,以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。

　　5 洗涤

　　洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。ELISIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤是zui主要的关键技术,应引起操作者的高度重视。现将我们在洗板中遇到的几个问题归纳如下:

　　5. 1血液凝固不全引起的假阳性血液凝固不全时有纤维吸附现象,致使洗板不净,残留的非固相酶产生的非特异性显色影响结果,而且这种显色很深易误认为强阳性。据统计,我们对12例这种现象的阳性结果进行重新分离血清再测定,结果其中有10例为阴性,2例为真阳性,且乙肝五项1例为大三阳1例为小三阳。所以在洗板完毕，拍板时要注意观察孔内是否有纤维蛋白原吸附现象,因此而出现的阳性应重新复查。

　　5. 2 洗液要临用前新鲜配制,放置时间过长易产生絮状物或混浊,造成赌孔或花板。

　　5. 3 洗板时间我科使用上海荣盛公司提供的 EL ISA检测HBsAg的试剂 ,说明书介绍洗涤5次,间隔5 s～15s进行洗板。经过长期实验摸索,我们改为洗涤6次,间隔30s,这样可避免洗涤不净而引起的假阳性。我们曾做过对比试验:84份血清标本以上述两种洗板方法分别测定HBsAg,结果5次15s有2例阳性 , 3例弱阳性,而6次30s洗板有1例阳性其为阴性。后经五项指标检查只有同时阳性的1例为大三阳;2例抗 2HBs阳性其余指标阴性,故不支持 HBsAg阳性结果,是由于洗板不净而引起的假阳性。

　　6 比色与结果判定应注意的问题

　　显色后一定要在规定时间内进行比色。判读结果不能仅用目测 ,一定要用酶标仪测定 ,上酶标仪要注意板条各孔中比色液体积的一致,否则会产生误差。我们曾做过对比试验:取清洁板条24孔每孔加蒸馏水100ul,用博赛2010型酶标仪,波长450测定其吸光度,均值A =0. 015,取出板条每孔补加蒸馏水50 ul及蒸馏水150 ul,同条件下测定其吸光度,均值A= 0.009,结果孔内100 ul体积的吸光度显著高于 150ul体积,原因是比色液体积较少即液面较低与孔内壁的折光较强而使吸光度增高。故测定中应注意滴加显色剂及终止液的量。

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