实验技术：免疫荧光技术中标本制作与注意事项

　　一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

　　1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

　　2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

　　3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

　　4、免疫荧光在封片时常使用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

　　5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

　　6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

　　二、注意事项

　　1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

　　2、每次试验均需设置以下三种对照：

　　(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

　　(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

　　(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

　　三、免疫荧光双标的经验之谈

　　1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

　　2、两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。

　　3、阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

　　4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，用的是10%正常donkey血清。

　　5、其余事项同免疫荧光单标操作。

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