古朵生物—细胞凋亡检测操作步骤之ELISA法

　　细胞凋亡发生时，内源性核酸内切酶将分解核小体区间的双链DNA，但核小体本身由于由组蛋白紧密结合而免受切割，单克隆抗体可以与核小体形成夹心结构，可通过检测核小体判断细胞是否经历凋亡事件。

　　(一) 原理

　　细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

　　(二)材料与试剂

　　1.采用Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

　　体。

　　2.过氧化物酶(-POD)标记的小鼠抗DNA单克隆抗体

　　3.链霉亲合素包被的微孔板

　　4.DNA-组蛋白复合物，作为阴性对照。

　　5.ABTS底物

　　6.溶解缓冲液

　　7.温育缓冲液

　　8.底物缓冲液

　　(三)样品

　　1.培养细胞或离体细胞的裂解物细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。

　　2.培养细胞的上清液

　　3.血浆(血清)

　　(四)操作方法

　　1.取样品离心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

　　2.另加入80µl免疫反应试剂含抗-DNA-POD、抗组蛋白及温育缓冲液(按1︰1︰18混合)，室温下孵育2h(置摇床上，250r/min)。

　　3.取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。

　　4.加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合(置摇床上)。

　　5.尽快作比色分析(10min～20min内)，用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

　　(五)结果判定

　　按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

　　注：mU=吸收值(10-3)=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

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