【古朵生物】蛋白浓度测定和操作说明

　　蛋白浓度检测是一个实验，是根据吸光值可以推算出蛋白浓度.碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

　　操作说明

　　一. 微孔酶标仪法

　　1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积 BCA试剂A 加1体积 BCA试剂B(50:1)配制成 BCA工作液，充分混匀 (混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。

　　2. 稀释标准品：取 10μL BSA 标准品用 PBS 稀释至 100μL(样品一般可用 PBS 稀释)，使终浓度为 0.5mg/ml。将标准品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 μL加到 96 孔板的蛋白标准品孔中，加 PBS 补足至 20μL。

　　3. 将样品作适当稀释(最好多做几个梯度，如作 2 倍、4 倍、8 倍稀释)，加 20μL到 96 孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线 1/2 后。

　　4. 各孔加入 200μL BCA 工作液，37℃放置 15-30 分钟。用酶标仪测定 A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

　　二. 蛋白浓度分光光度计法

　　如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。

　　蛋白浓度注意事项：

　　1. 长期不用时，BCA试剂B与PBS 稀释液可置于 2-8℃保存，如发现细菌污染则应丢弃。BCA试剂A在低温条件下出现结晶沉淀时，可 37℃温育使其溶解, 不影响使用。

　　2. 样品中若含有较多干扰物质时，请采用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。

　　3. 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白不蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。

　　4. 待测蛋白和蛋白标准加入 BCA 工作液后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置 2h或 60℃放置 30min，颜色会随着时间的延长不断加深。显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。

　　5. 为了加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但是切勿过热，否则易失效。

　　6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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