技术文章：冰冻切片多重免疫荧光试剂盒(三标四色)

　　冰冻切片多重免疫荧光试剂盒(三标四色)

　　原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法 ，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色"步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨s等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

　　TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨s、组氨s酸和酪氨s残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨s残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

　　试剂盒规格：100T

　　试剂盒组成：

　　名称规格保存条件

　　TYR-520荧光染料(绿光)即用型，5mL-20℃

　　TYR-570荧光染料(红光)即用型，5mL-20℃

　　TYR-690荧光染料(粉光)即用型，5mL-20℃

　　TSA+增强剂(可选)浓缩型，50μl-20℃

　　抗体洗脱液即用型，30mLRT

　　HRP-山羊抗兔二抗即用型，15mL4℃

　　备注：TYR-520荧光染料 、TYR-570荧光染料 在-20度下 ，均为固体，使用之前需解冻。

　　TSA+增强剂使用方法：TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍，TSA+增强剂：TYR荧光放大液=1:500，使用TSA+增强剂不是必须的选项，可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。

　　操作流程：

　　爬片准备：多聚甲醛固定15min，PBS洗涤三次，每次5min，Tritonx100 破膜15min，PBS洗涤三次，每次5min。

　　阻断内源性过氧化物酶：滴加3%过氧化q溶液，室温避光孵育15 min， PBS洗涤3次，每次5min。

　　BSA封闭:滴加用3% BSA-PBS(或者其他封闭液)均匀覆盖细胞爬片，室温封闭30min(如果爬片盖玻片较大可用组化笔在盖玻片四周画圈)。

　　加一抗：轻轻吸掉封闭液，滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，避光4°C孵育过夜。

　　加hrp二抗： PBS洗涤3次，每次5min。滴加与一抗相应种属的hrp二抗，避光室温孵育50min,PBS洗涤3次，每次5min。

　　荧光染料反应：TYRXXX荧光染料反应 2-15min，PBS洗三次，每次5min。

　　上一轮抗体洗脱：滴加适量37度预热至溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37度放置5-20分钟，弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟。

　　重复2-6步骤(换用另外一种TYRXXX荧光染料)

　　DAPI复染细胞核： PBS洗涤3次，每次5min。弃PBS，滴加DAPI染液，避光室温孵育10min，PBS洗三次，每次5分钟。

　　封片：干净的载玻片做好标记，用针轻轻挑出盖玻片，用抗荧光淬灭封片剂封片。

　　镜检拍照：样本于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

　　染料激发波长发射波长

　　DAPI 蓝色350420

　　TYR-480450480

　　TYR-520绿色490520

　　TYR-570红色550570

　　TYR-620590620

　　TYR-690630690

　　TYR-780750780

　　文章引用试剂盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Four-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

　　冰冻切片多重免疫荧光试剂盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。