Elisa实验：ELISA数据结果如何来判断实验结果的好坏

　　酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)指将抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合的专一性，并结合酶对底物的高效催化作用， 通过底物的显色反应及颜色深浅，进行定性或定量的一种检测方法。

　　ELISA为固相非均相反应，依检测原理，主要分为三种：夹心ELISA法、竞争ELISA法、间接ELISA法;夹心法又可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法;竞争法有直接竞争法、间接竞争法。基于目的的不同，又可分为定量ELISA和定性ELISA。

　　ELISA作为起源于19世纪的一项成熟检测技术，因其具有的优点而应用广泛。

　　概括而言，其检测主要操作步骤有加样、温育、洗板、显色、判读;相应的所需仪器则较普遍常用，如酶标仪(多功能酶标仪)、恒温培养箱或水浴锅、自动洗板机、微孔振荡器;其他如排枪、量筒等实验室更为常用。

　　而对于实验者来说，准确、、可重复性的实验结果是最佳的，若要取得理想的ELISA实验结果，需从影响ELISA检测结果的因素着手，多加注意 。

　　纵观全局，影响因素不外乎以下几个方面：

　　1、样品方面

　　ELISA作为一项成熟的检测技术，适用于多种样本的检测。其中血清、血浆、尿液、唾液等样本较为常见，规范的取样操作、合适的存放条件都是保证检测结果准确的必要条件。

　　实际上，样本采集、存放过程中很多因素可能引起检测结果的差异，如溶血样本由于红细胞裂解释放出具有过氧化酶活性的物质，进而发生非特异性显色反应，产生假阳性 。

　　部分资料显示，对于溶血样本，可以测定血清Hb浓度判断溶血程度。非溶血标本血清游离Hb为4.8±3.2mg/dL，中度溶血血清Hb为43.5±13.9mg/dL。超过此范围的样本最好做复检，避免假阳性结果

　　依据检测指标，选择合适的样本，而对于较为敏感指标(如LDH、ACP等)，即使轻微溶血也可能导致测定结果偏高，此类样本应尽量避免使用。

　　对于溶血判断，较为简易便捷的方法则是肉眼观察，当血清清亮，呈樱红色，为中度溶血，此时需重新采集。为更好避免溶血情况发生，建议SST管或抗凝管采样。

　　高脂血同样也是比较常见的，严重的也称为牛奶血，呈乳白色或混浊状，其通过不均一性、脂质颗粒粘附在管壁等影响检测结果。理论采用高速离心可除去，但可能对检测结果有影响。另外，样本污染或存放不当都会对检测结果造成影响，如样本受到细菌污染，则会产生非特异性显色而干扰结果;塑料管能吸附抗原使样本内抗原含量下降，容易假阴性，最好使用真空采血管。

　　2、操作方面

　　ELISA是一项可重复性很高的检测技术，操作简便易行，但操作中的各个环节对实验的检测效果影响较大，正确严格的操作是保证实验成果的关键。

　　对于加样：ELISA是基于微孔板的反应，所需样本量较小，若样本粘附于孔壁或加样量不足，微孔板内样本量不足以参与与抗原或抗体的反应，则会出现假阴性结果。

　　因此充足的样本量是首要条件，考虑使用准确性高的移液器且定期进行校正，加样时宜垂直悬空加入微孔底部，需注意避免碰到管底或管壁，防止溅出或产生气泡，同时更换枪头，做到“一样一吸头"，避免交叉污染。对于温育：ELISA是基于抗原抗体特异性结合的反应，抗原抗体反应需要合适的温度。对于大多数抗原抗体，37℃是最佳反应温度，结合效率高。

　　ELISA操作中需将酶标板置于合适的温度温育，由于酶标板结构特别，较易产生边缘效应，同时基于很多恒温箱构造，温度显示并非酶标板温育温度，导致个别样本检测结果异常。可选用水浴法温育，避免受热不均产生边缘效应，同时贴上密封膜防止污染或液体蒸发，切勿缩短温育时间。对于洗板：其目的在于除去非特异性成分，使免疫复合物与待测抗体 (抗原) 呈一定比例，洗板是ELISA操作中重要的环节。

　　有条件的实验室，可采用机洗，可在一定程度避免污染，提高效率，需注意观察洗液针、冲洗头是否通畅 ，这是考虑到血清中残留纤维蛋白丝或洗涤液有析出的结晶存在时，易使洗板机针孔阻塞;调整注水量，设置好洗板时间及次数、力度，避免力度过大造成酶结合物丢失，检测结果偏低。

　　对于不方便的实验室，则可用手洗，可反复模拟操作，避免洗板不干净造成“花板"，影响检测结果。洗板结束后将板垂直扣于干净的吸水纸或毛巾上，拍干。对于显色及判读：ELISA多用HRP为催化酶，作用于TMB发生显色。显色是最后一步温育反应，研究表明，显色温度对实验结果有明显影响，温度过低导致结合反应速率变慢，显色不充分，容易漏检低值结果。

　　而显色时间不宜过短，鉴于一些低滴度可能不能及时出现反应，造成假阴性结果。严格控制显色反应的温度和时间至关重要。

　　ELISA测定需要通过酶标仪测定，研究资料建议选双波长，可以减少测定干扰和电路干扰 ，提高临界值处的样本的分析正确度，减少对弱阳性样本的漏检，从而减少实验误差。

　　3、试剂方面

　　市场ELISA产品众多，眼花缭乱，参差不齐，高质量的产品仍然是重中之重 ，也是保证实验结果可靠的先决条件。选择度相对高的试剂。切忌不要混用，更不要使用过期试剂。实验操作前，通常需将试剂从冰箱拿出，平衡30-60min，使微孔内温度较快达到所需温度，而忽略这一操作可能导致一些弱阳性的样本出现假阴性。

　　综上所述，影响ELISA结果的因素有很多，无论是样品、操作还是试剂都可能影响到最终的实验结果。因此，在进行ELISA检测时，要采取相应措施排除干扰因素，同时严格执行SOP标准化规程，认真做好ELISA全程质量控制，保证ELISA检测结果的准确度。

　　elisa试剂盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。