大鼠IV型胶原酶(COL-IV)酶联免疫检测试剂盒使用说明书

　　本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测大鼠IV型胶原酶(COL-IV)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

　　用 途：用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中IV型胶原酶(COL-IV)测定。

　　工作原理:

　　本试剂盒采用的是生物s双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中大鼠IV型胶原酶(COL-IV)水平。向预先包被了大鼠IV型胶原酶(COL-IV)单克隆抗体的酶标孔中加入大鼠IV型胶原酶(COL-IV)，温育;温育后，加入生物s标记的抗IV型胶原酶(COL-IV)抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠IV型胶原酶(COL-IV)的浓度呈正相关。

　　试剂盒组成:

　　试剂盒组成48孔配置96孔配置保存

　　说明书1份1份

　　封板膜2片(48)2片(96)

　　密封袋1个1个

　　酶标包被板1×481×962-8℃保存

　　标准品12ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

　　标准品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　链霉亲和素-HRP3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　生物s标记的抗COL-IV抗体0.5ml×1瓶1 ml×1瓶2-8℃保存

　　显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　浓缩洗涤液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

　　需要而未提供的试剂和器材:

　　37℃恒温箱。

　　标准规格酶标仪。

　　精密移液器及一次性吸头

　　蒸馏水，

　　一次性试管

　　吸水纸

　　注意事项:

　　从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

　　严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

　　为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

　　不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

　　底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

　　洗板方法:

　　手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

　　自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

　　标本要求:

　　1.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

　　2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

　　操作程序:

　　标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)

　　6ng/ml5号标准品120μl的原倍标准品加入120μl标准品稀释液

　　3ng/ml4号标准品120μl的5号标准品加入120μl标准品稀释液

　　1.5ng/ml3号标准品120μl的4号标准品加入120μl标准品稀释液

　　0.75ng/ml2号标准品120μl的3号标准品加入120μl标准品稀释液

　　0.375ng/ml1号标准品120μl的2号标准品加入120μl标准品稀释液

　　根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

　　加样：1)空白孔，空白对照孔不加样品，生物s标记的抗COL-IV抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同;2)标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物s抗体，故不加);3)待测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗COL-IV抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。

　　配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

　　洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

　　终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

　　测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

　　根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

　　操作程序总结：

　　试剂盒性能：

　　1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。

　　2.批内与批间应分别小于9%和15%

　　检测范围：

　　检测范围：0.2ng/ml - 9 ng/ml

　　保存条件及有效期：

　　保存：2-8℃。

　　有效期：6个月(2-8℃)。

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