ELISA试剂盒的制备标准及方法

　　在ELISA试剂盒过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA试剂盒测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。

　　在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入(吐温，Tween)一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在ELISA试剂盒中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。

　　elisa试剂盒的制备标准：

　　因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物(见3.6)。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本(sample，S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。a.阳性判定值阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。

　　用此法判断结果要求实验条件十分恒定，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml.每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400)，试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阳性判定值=NCX+0.05　标本A值>阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。

　　应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05(或其他数值)，则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。

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