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琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)使用方法

点击次数:89 发布时间:2019/3/27
提 供 商: 上海古朵生物科技有限公司 资料大小: JPG
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名称: 琼脂糖凝胶4B(Sepharose4B)
排阻极限:60000~20*106(球蛋白)

供应商:古朵生物
形状:球型
粒径:50-160μm
流速:11.5cm/h
耐压:0.008MPa
ph工作范围:1-9(长时间),3-11(短时间,在位清洗)
包装:10L、5L、500ml、100ml、25ml
应用:用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的凝胶色谱纯化
规格:100ml
保存条件: -20℃
类别:分子 PCR

 


这里介绍部分填料使用说明:对于凝胶过滤来说,层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5~1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20~1︰100。

凝胶柱的装填方法和要求,基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致,没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后,将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素,或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱,观察色带是否均匀下移,以鉴定新装柱的技术质量是否合格,否则,必须重新装填。
1 化学和物理性质。
葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶,含有大量的羟基,很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度,因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。
葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程,可在较低的压力下获得较高的流速。另外,粗级也可用于批量工艺。
1.1 化学稳定性
葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂(除非它被化学降解)。它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的,在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶,因而应避免使用。
1.2 物理稳定性
葡聚糖凝胶并不熔融,可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。


2  使用方法
2.1 乙醇浸泡
    在室温下,将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时,并不断搅拌以保证凝胶溶胀,用无盐水洗去残存的乙醇滤干。
2.2 无盐水浸泡
    室温下,在无盐水中充分溶胀24小时,间隙搅拌,以保证凝胶的完全溶胀。
2.3 盐酸浸泡
    在常温下再用0.1M HCl浸泡12小时,间隙搅拌,滤干,水洗只中性。
2.4 装柱
将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内,注意保持湿态装柱,并避免柱内产生气泡或断层。
2.5 平衡
上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值)。
2.6 上样
凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积,我们建议初次上样控制在1-2%的床体积,视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积,柱高的选择也与分离要求相关,柱高控制在40-50cm以下,过高的凝胶层会引起较大的反压,应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制,脱盐时高径比为5:1即可。
2.7 洗脱方法
    可以用无盐水,也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。
2.8 清洗
    每次用完之后,将柱子里的缓冲液置换为去离子水,然后用20%的乙醇封存。
2.9 在位清洗(CIP)
     凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。


3.1 色谱柱装填
(1)所需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体zui好做脱气处理。填料可直接称量需要的量用缓冲液溶涨一小时装柱即可,如果不好溶胀,可适当加热。
(2)在柱子下端加入20%乙醇,以除去柱子中的空气,关闭柱子出口,在柱内保留少量的20%乙醇。20%乙醇容易产生气泡,可以在里面加1%吐温避免气泡产生。也可以换成纯水装柱子,但是需要把填料中的20%乙醇也换成纯水,具体的方法取需要体积的填料在抽滤漏斗上进行,也可以小心倾去填料上的20%乙醇,再换成5倍体积的纯水,反复沉淀去上清,5次左右就可以用于装柱子。
(3)此填料颗粒比较细,所以一定要注意柱子要选择合适的筛网,不能漏,也可以取点填料加到筛网上试试,如果没有问题再将填料连续倒入柱子时,要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流,以减少气泡的产生,让填料先自然沉降到填料体积不再变化,而填料和上面的液体很好分层,上层溶液完全澄清,就可以开泵用适当的流速压柱子,填料体积不再变化后,再把转换头紧顶在填料上就可以平衡柱子使用。使用的流速要小于装柱子的流速。
(4)在装柱子前,填料从冰箱中取出至少要室温放置2-3个小时,这样避免装柱子时由于温度变化而使柱子中产生气泡。
3.2 蛋白的结合
样品的盐浓度和pH要尽量和平衡柱子的缓冲液一致,盐浓度过高或者pH带低也许挂不上,所以要根据自己的样品做适当调整。
3.3 蛋白的洗脱
这个填料如果采用线性梯度洗脱,柱子的直径和高度比zui好是大于10,数值越大越有利于分离,而且样品zui好别上太多,可以按约10mg/ml上样,如果采用阶段洗脱的方法,装短粗柱子就可以,上样量也没有限制。阶段洗脱容易放大,重复性好,如果洗脱条件好完全可以得到和线性梯度一样或者更好。采用什么方法完全根据自己需要。


4 再生清洗
(1)用完之后用0.1M 醋酸洗5个柱体积,然后用2M NaCl洗5个床体积,再用水洗至中性,然后用20%乙醇保存。
(2)有机溶剂和水混合很容易产生气泡,为了避免这样情况,可以把配好的有机溶剂在室温放置过夜,再使用,这样可以避免气泡进柱子而导致柱子不能正常使用。


5 保存
在20%乙醇中,4℃下长期保存。
特别注意:
上样之前,样品至少用0.45微米膜过滤,尽量去除色素,否则色素会被吸附到填料上,影响填料的正常使用。
在使用过程中,不能使用强酸强碱,酸和碱的浓度应低于0.15摩尔。

 
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