18321664727
返回首页 在线留言 联系我们
首页 > 企业动态 > 3重组质粒是怎么筛选和鉴定的呢?

企业动态

3重组质粒是怎么筛选和鉴定的呢?
更新时间:2018-08-27   点击次数:3935次

重组质粒的筛选是质粒构建的重要步骤,重组子是筛出来的,这个命题没有问题。问题是关键步骤不在筛选。影响重组质粒构建效率的关键步骤在于酶切,不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净,*的酶切反应是成功的一半,尤其是载体的酶切。

 

 


1)  酶切反应的前提是对质粒载体的大致定量,一般大小的质粒(3-5kb)一次连接的用量在100ng左右,一般挖胶回收的损失在50%左右,为保证一次酶切反应可以进行至少三次连接,质粒载体的量在1微克左右较合适。太多的载体用量对酶切效率有负面影响,而太少的质粒载体不能保证实验的需要。


2)  然后使用过量2倍以上的酶量进行反应(按照酶切时间一小时计算,酶活性单位的定义可以参见公司的目录,一般一个单位的定义是指推荐条件下消化1微克的lambda DNA所需的酶量),反应时间2小时——过夜(不要超过10小时)。我们实验室一般采用较长的酶切时间,没有遇到过问题,但是也有实验室酶切时间控制较严格。但是原则是质粒载体一定要酶切*。


3)  挖胶回收,现在很多的国产试剂盒可以保证50%以上的回收效率。采用低熔点胶或电洗脱也是很多实验室的选择。


4)  连接,关键点是载体和片断的比例以及用量。对于定向克隆片断与载体的摩尔比一半大于2,非定向克隆一般大于5-10。一般大小的质粒载体(3-5kb)一次连接的用量在100ng左右。胶回收后建议对载体和片断进行定量。连接反应我们一般使用NEB的连接酶或Takara的ligation 试剂盒,这两种产品允许快速连接。其它很多公司的普通连接酶也不错。


5)  在影响克隆效率的诸多因素中酶切效率是为关键的步骤,因为酶切不*导致的空载体背景是绝大多数克隆操作失败的原因,极少数酶切反应不*的产物可能在转化后形成非常高的空载体背景。对于非定向克隆来说,碱性磷酸酶消化是另一非常关键的步骤,但是这也是在建立在酶切反应*的前提之下。
重组子筛选时,对于定向克隆我们一般挑取的菌斑数为4个,对于非定向克隆,我们一般挑取8个,如果筛不到重组子,我们一般从酶切载体开始重做,因为我们发现,4-8个菌落中挑不到重组子时,继续筛选所费的努力通常得不偿失。

分享到:

返回列表 | 返回顶部
上一篇 : 分子诊断: qPCR二代测序NGS和数字PCR如何选?    下一篇 :  GET 这些技能,你的实验就成功了一半
网站首页 公司简介 产品中心 招聘中心 技术支持 企业动态 联系我们 管理登陆
上海古朵生物科技有限公司版权所有 主营:优质胎牛血清,EA36染色液配制,迪夫快速染色液
GoogleSitemap ICP备案号:沪ICP备19048203号-2 技术支持:智慧城市网
在线客服