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如何添加优化的慢病毒量?确定靶细胞 MOI 值
发布时间:2018-09-14   点击次数:11460次


不论是对活体还是体外培养的哺乳动物细胞,慢病毒表达载体对遗传物质的转导效率至关重要。慢病毒早起源于人免疫缺陷病毒 (HIV) 或猫免疫缺陷病毒(FIV),能够感染几乎所有类型的细胞,包括难以用质粒转染甚至无法用质粒转染的细胞。


许多客户对如何用慢病毒颗粒进行转导持有疑问,特别是对如何选择适合的慢病毒量感到困惑。这个问题可根据确定细胞的感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)来解决。

 

 

 


什么是 MOI?
选购慢病毒颗粒之前,首先需了解目的细胞的感染复数:MOI。MOI 的概念很简单,可有效感染细胞的慢病毒颗粒数与被感染细胞数的比值即为该细胞的 MOI 值。


例如,应用 106 TU 慢病毒感染 106 个细胞可成功使 80% 以上细胞达到转导目的时,MOI=1;如需要以 5 × 106 TU 病毒才可成功感染 106 个细胞,则 MOI = 5。(TU/mL 为慢病毒滴度单位,TU 表示有活性的慢病毒量)


如何确定目的细胞的 MOI 值?
慢病毒对不同类型细胞的转导效率各不相同,因此 MOI 也各异。在此,我们列出了多种常用细胞系的 MOI,助您选购合适的慢病毒量。下表是 GeneCopoeia 通过实验摸索得出的多种细胞系的 MOI 参考值。


了解慢病毒滴度是获得 MOI 的前提条件。根据上表,若您的实验对象是ru腺癌细胞系 MCF-7,其 MOI 参考值= 2,那么当您购买了 50μL 的慢病毒颗粒(滴度是 108 TU/mL)时,您得到的慢病毒总量为 5×106TU。在 MOI= 2 的条件下,您所购买的慢病毒足够转导 MCF-7 在 24 孔板中铺板培养的其中 5 孔(约合 4×105 细胞/孔)。若您的目的细胞系 MOI 要求较高,您需要购买或自行包装更多慢病毒颗粒。


请注意:
上表所示的 MOI 值仅供您选购慢病毒时作为用量参考。根据细胞状态、操作手法等的差别,实际数据可能有轻微浮动。所以当您收到所购买的慢病毒时,我们仍然建议您通过设计梯度 MOI 感染小量细胞实验(如:MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.)检测目的细胞的转导效率,确认其 MOI 值。另外,若您的实验细胞未被列在上表中,梯度实验确定 MOI 是至关重要,甚至必不可少的。您可将病毒进行梯度稀释,分别感染等量的细胞。


进行转导的 1 天前,于 96 孔板铺板培养目的细胞 (实例中使用了 H1299 细胞);在进行转导当天,以 10 倍梯度稀释慢病毒并分别进行转导;转导 72 小时后以荧光显微镜观察 GFP 报告基因表达情况,确定该细胞在转导效果下的慢病毒量。


后,若您的实验细胞要求较高的 MOI 值, 您还可通过以下几种方法将其降低。方法一是加入 polybrene (hexadimethrine bromide), 一种能够减少病毒与细胞膜间电荷排斥作用的阳离子聚合物。另一种方法是使用能够捕获慢病毒颗粒的磁珠(例如,利用磁珠可成功地将 MM-AN 细胞的 MOI 从 16 降到 4)。购买或构建克隆时,可选择载体骨架上带有标记基因(如:Puromycin, Neomycin 等)的克隆,可方便后续进行药物筛选,建立将目的基因成功地随机整合到特定细胞的稳定细胞株。


GeneCopoeia 提供基于慢病毒表达载体的人源及小鼠源的 ORF, 启动子,shRNA, pre-miRNA, microRNA inhibitor, 以及 CRISPR sgRNA 表达克隆(质粒)。另外,我们还提供慢病毒包装服务、LentiFectTM 慢病毒包装试剂盒(包含滴度增强剂),慢病毒浓缩试剂和 EndofectinTM 转染试剂等,实现一站式慢病毒解决方案。

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