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用免洗ELISA——HTRF技术赢取宝贵时间
发布时间:2018-11-29   点击次数:276次

HTRF(均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )技术快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化,其作为药物研发领域的领先技术,并广泛用于信号转导研究和免疫检测。该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。


HTRF介绍
HTRF(均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF, Time-Resolved Fluorescence)两种技术。HTRF是基于TR-FRET的化学技术,拥有与其它TR-FRET技术相似的特征,HTRF技术的能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)具有非常长的半衰期,很大的Stroke's shift等。HTRF数据分析方面,有来自于能量供体和能量受体的两个发射光,可采用Cisbio的比值法来分析数据,从而去除由于溶液通透率、细胞大小、细胞数量等不同引起的误差。

HTRF技术的优势
操作非常简单  实验过程不需要繁琐的洗板,只需要混匀孵育后检测
体系非常稳定 穴状化合物非常稳定,可耐受较宽的pH范围、二价金属离子、螯合物等,并且可以在至少48小时内反复多次检测
数据真实可靠  背景低,受到样品的干扰非常少,假阳性假阴性均低,尤其可去除由于天热产物自发荧光等引起的干扰
应用灵活多样  HTRF可以看作是不需洗涤的ELISA,应用范围很宽
易于实现微型化,通量高


HTRF应用解决方案
HTRF技术从产生以来,已经被广泛应用于免疫检测和细胞信号转导的研究,在药物研发中被应用于不同的阶段,从实验方法的建立、高通量筛选(HTS),lead到hit,一直到临床前研究。HTRF技术非常灵敏而且稳定,可以进行细胞实验和生化实验,并且可以使用384和1536孔板。HTRF的很多应用是基于抗体的检测,包括GPCR(受体配体结合,受体二聚化,cAMP 和IP-1 的检测,以及磷酸化ERK和AKT的定量)、激酶、细胞因子和生物标志物、生物过程(治疗性抗体和蛋白药物的生产)等,以及蛋白和蛋白、蛋白和多肽、蛋白和DNA/RNA相互作用的研究。HTRF具有与ELISA同等的检测范围和检测极限,但是它不需要洗板,可以极大地减少实验时间,所以HTRF技术可以取代大部分ELISA实验,为均相ELISA。


G蛋白偶联受体的解决方案
HTRF技术可用来进行第二信使检测、胞内信号分子检测和受体配体结合检测方案,从而从帮助您进行G蛋白偶联受体的研究。


HTRF激酶检测解决方案
HTRF KinEASETM利用标记了镧系元素Eu3+的特异性磷酸化位点的单抗以及XL665标记的链霉亲和素跟生物素化的底物形成夹心实验。整个实验包含两步:
酶反应步骤:激酶在有或者没有化合物的条件下跟特异的底物混合,加入ATP起始反应。
检测步骤:加入用检测缓冲液配置的单抗-Eu3+和XL665,在检测缓冲液中含有EDTA,因此能够终止激酶反应。以上两种检测试剂可以先混合以减少加样步骤。


HTRF细胞因子检测
HTRF细胞因子检测是基于双抗体夹心法,包括两个单克隆抗体(MAb):铕标记的抗细胞因子抗体MAb1和XL665标记的抗细胞因子抗体MAb2。MAb1和MAb2分别与细胞因子结合,发生能量共振转移,产生荧光信号,荧光信号与细胞因子的浓度成正比。


HTRF生物过程和抗体药物研发解决方案
在治疗性抗体的研发和筛选过程中,通常需要经过以下步骤:首先基于生物化学结合反应,利用HTRF或ELISA技术从几千至上万的样本库中筛选目标候选样本。在确定候选样本可以与表面受体结合后,进一步从细胞水平确定候选样本与细胞的结合能力。随后,确定候选样本的Kd,Kon/off 和 IC50值,对抗体药物的亲和力等特性进行确定,后一步是进行抗体药物的功能试验,如抗体药物激活细胞表面受体后,cAMP和IP-One的表达水平等等

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