近日来自霍华德• 休斯医学院Janelia Farm Research研究所的科学家们开发了一种新型显微镜技术，并利用这一技术中在单个活细胞中获得了高分辨率的三维（3D）亚细胞影像。研究人员将这一新技术命名为“贝塞尔光束平面照明显微镜”（ Bessel beam plane illumination microscopy），这种显微镜将帮助研究人员比以往更深入地观察活体中的生物进程。相关研究成果发表在3月4日的《自然方法学》（Nature methods）杂志上。

  这一研究小组的负责人是霍华德• 休斯医学研究所的Eric Betzig教授。他从事高分辨显微镜技术的开发及研究工作已超过30年。“尽管在这30年里取得了飞速的发展，然而由于大量的显微镜技术都需要对将样本进行切割和固定成像，因而获得的只能是来自死细胞的静态图像，从而阻碍了显微镜技术应用到更广泛的研究领域，”Eric Betzig说。

 

早在2006年，Betzig就着手研究改良活细胞显微镜技术的新途径。当时他将设计新显微镜技术的焦点放在了突破空间分辨率的限制上。在不久后，Betzig以及同事Harald Hess就开发出了一种光敏定位显微镜（PALM），PALM可以用来在10-20纳米范围内观察生物图像，相对于电子显微镜有更清晰的对比度。

    然而PALM与大多数其他显微镜一样，其工作原理是通过物镜投射光层使样本曝光，然后再将光线重新积聚返回至同一物镜中。这种方法中采用的光线有可能对样品造成损伤，并导致生成的影像模糊，因而无法对活细胞进行观察。

    2008年，Betzig便致力于攻克这些技术难题。他想到的一种方法就是利用平面照明显微镜技术。这一技术产生于100多年前，平面照明是指照射光线通过样品的侧面而非顶部。要达到这一效应，必须采用两个相互垂直的物镜。“平面照明可使光线接近于样品的焦点区域，”Betzig说。

    尽管其他的研究人员包括Janelia Farm Research研究所的工作人员Philipp Keller利用平面照明在数百纳米的范围内获得了多细胞生物体的影像。然而由于光层仍然太厚使得研究人员无法有效地在数十纳米的范围内对单细胞进行成像。利用平面照明获得的大片的光线仍然存在影像模糊和光损伤等问题。为了攻克这一难题，Betzig研究小组利用了贝塞尔光束（Bessel beam）。贝塞尔光束是物理学家们在20世纪80年代末发现的一种特异的无衍射光束，现在被广泛应用在超市的条形码扫描仪中。研究人员证实利用这种光束扫描样品可产生更薄的光层。

    此外，Betzig还采用了另一种称为双光子显微镜的策略，这种方法常用于神经科学研究中对脑组织进行分层成像。双光子显微镜技术的主要优势之一在于可使微弱曝光的区域生成极少的荧光信号。因此当使用双光子技术时，可在保留贝塞尔光束狭长中心光线的同时减少两侧的背景影像。

    基于这些策略研究人员成功地构建了贝塞尔光束平面照明显微镜。由于贝塞尔光束平面照明显微镜投射超薄的光层通过样本，移动通过超薄光层的样本形成每一层的图像。贝塞尔光束平面照明显微镜不会模糊光线，因此使样品的影像更为清晰锐利，而没有通常的背景影像。观察结束后，完成的样品还可以继续存活生长。贝塞尔光束平面照明显微镜还因使用超薄层光（thin slices of light）“扫描”样品，而非全部聚焦整个样品，因而将光线造成的损伤小化并有助于延续样品的生命。整个观测过程非常迅速，在一秒钟的时间内研究人员就可获得200个详细的影像，并在1-10秒钟内生成由数百张二维影像组合形成的分辨率为0.3 μm的的三维图像。

    在Janelia Farm的研究人员看来，贝塞尔光束平面照明显微镜的诞生对于基础研究和显微技术而言都是一个重要突破。因为它不仅比现有的显微技术更加强有力，而且为生物学家研究完整生物系统提供了锐利武器。Betzig强调说，贝塞尔光束平面照明显微镜对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构特别有价值，科学家藉此可以获得以往不可能得到的图像，因此它必将拓展人类科学研究的能力。