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【古朵生物】ELISA实验操作干货
更新时间:2023-10-23   点击次数:201次

ELISA实验操作干货

样本如何处理、收集、保存?

1.细胞培养上清

细胞培养液在2500rpm/min 离心20分钟后,收集上清即刻检测, 或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。

2.血清样本

分离管分离血清。在1000g离心之前,使血样凝集30分钟。吸取血清样本之后即刻检测,或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。

3. 血浆样本

EDTA、ghsn或肝素抗凝收集血浆样本。在血样收集3分钟内离心收集样本。即刻检测,或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。注:不要使用严重溶血或高血脂的样本。所有样本收集后,应及时分装并贮存于-20℃。如果在24小时内检测,样本可以存放在2 - 8℃。避免样本的反复冻融。在分析前,冷冻样本应该缓慢的恢复至室温,轻柔地混匀。检测前,样本中可见的沉淀必须去除。

已设阴性对照,还需空白对照吗?

首先要清楚空白对照和阴性的区别:

空白对照:仅用稀释液代替检测样本,用以观察最终反应的显色“本底",并用于酶标仪消除、扣除“本底",即以本底为“零’,读取阳性、阴性对照孔和样本孔的吸光值;

阴性对照:是本实验检测与待检物有同源性和同质性,又不含有待检物质,并能客观比较和鉴别处理因素之间的差异。

出现白板,什么原因呢?

如果显色完成后,肉眼可见整板没有显示反应,可能原因及应对方法详见下表。

序号可能原因解决方案
1试剂盒储存不当;不同试剂盒试剂混用购买新的试剂盒,注意储存条件;不可混用
2孵育温度低,时间短如果温度偏低,则延长孵育时间和显色时间
3错加、漏加试剂严格按照说明书步骤添加正确试剂
4用于配置溶液的容器不干净,或水有问题使用干净容器以及合格的蒸馏水
5检测抗体和/或HRP浓度太低照说明书,不可随意稀释
6试剂温度不均一所有试剂要室温平衡 30 min
7洗板过程中浸泡时间长,洗板次数太多,洗板冲击力大严格按说明书操作

出现花板,什么原因呢?

花板是指空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常,而标本孔的吸光度(OD 值)却明显偏高,可能原因及应对方法详见下表。

序号可能原因解决方案
1洗涤次数少,不充分按说明书要求洗涤
2底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB )被金属离子或氧化剂污染或曝光配置时使用干净容器以及合格蒸馏水;避光保存
3孵育温度高和/或时间过长控制孵育和最后酶促反应的温度和时间
4加样时未更换枪头,造成交叉污染每个样都更换枪头
5附近孔交叉污染洗涤时,洗液不可溢出孔洞,垂直拍板;
使用合适的拍板纸,避免孔内进入纸屑尘渣;
孵育时封板要严密,防止阳性标本的液体蒸发
6样本存在内源性干扰物质推测可能的感染物质,并进行对应处理
7样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响等避免溶血、污染、过久储存等现象

标曲不佳,什么原因呢?

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释,但标准曲线最高点 OD 值偏高或偏低,且没有梯度,可能原因及应对方法详见下表。当然,也会存在酶标板封闭不足、本底不稳定的情况。

结果可能原因解决方案
标曲最高OD太高(> 3.0)TMB 孵育时间太长调整孵育时间
指纹、杂质影响双波长检测,去背景
标曲最高OD正常标准品进行下一步稀释前没有混匀先混匀,再移液
不同试剂盒或批号的试剂混用不能混用
检测抗体浓度过高按照说明书调整到最佳浓度
孵育时未加盖导致挥发和污染贴封片或加盖
孔间污染加样及洗板时防止孔间污染
标曲最高点OD低(< 0.8)显色时间不够S1、S2深蓝色,梯度明显,S5有淡蓝色时可终止
粉末标准品未充分溶解粉末标准品按说明书加一定体积的液体后,轻柔混匀,室温静置 30 min,充分溶解
标准品反复冻融标准品反复冻融后活性降低;购置新的标准品
孵育温度、时间所有试剂室温(~25 ℃)平衡 30 min,孵育时间按照说明书指示
洗涤浸泡时间过长按照说明书操作,勿人为增加浸泡时间
酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥防止板过于干燥
不同试剂盒或批号的试剂混用不能混用
显色液变质更换新的显色液

标曲正常,样本吸光值极低,什么原因?

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释,但标准曲线最高点 OD 值偏高或偏低,且没有梯度,可能原因及应对方法详见下表。当然,也会存在酶标板封闭不足、本底不稳定的情况。

此外,如果肉眼观察酶标板显色正常,而上机所测 OD 异常,可检测酶标仪参数的设定以及滤光片是否匹配。洗涤液多为非离子型中性缓冲液,既含有亲水集团,也含有疏水基团,可以使吸附在酶标板上的蛋白解离而溶于水中,去除非特异性吸附物质,但是浓度太高时,会引起包被抗体脱落。所以需要正确稀释。同时应该用高质量的纯净水稀释,不能引入别的离子,以免对抗原抗体结合和酶促反应产生影响。

序号可能原因解决方案
1样品不适合做 ELISA 检测样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做 ELISA 检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分)
2样本含量低于灵敏度浓缩样本或使用高敏试剂盒,避免反复冻融
3样本存于吸附性强的试管中选择蛋白吸附能力低的硅化 EP 管
4冻融后,蛋白凝集,分布不均样本避免反复冻融

上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品,励志研发和销售的综合性生物公司,产品远销多个国家和地区,我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向,不断开发高质量的新产品,提供客户满意的综合服务质量"的方针。古朵试剂盒

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