免疫细胞或组织化学染色的相关问题

　　附上我们这里的组化步鄹：(切片复温凉干完毕)：

　　1。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MPBS 20ml+30%过氧化氢 1ml)30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3;

　　2。加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100 1ml+0.01MPBS 100ml)30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3;

　　3。加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g+30% Triton X100 1ml)稀释的*抗体4℃反应24-48h。吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3;

　　4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育2h。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3;

　　5。加入ABC复合物，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3，蒸馏水迅速冲三次;

　　6。加入硫酸镍铵溶液(DAB 25mg+蒸馏水50ml+硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml+葡萄糖200mg+氯化铵40mg+葡萄糖氧化酶1mg)，进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应;

　　或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

　　7。梯度酒精(70%、80%、90%酒精5min×1，95%酒精5min×2，100%酒精5min×3)脱水之后，二甲苯透明，中性树脂封片。

　　而对培养的细胞则比较简单：(细胞种在玻片上)

　　1。固定液固定10-30min，0.01MPBS清洗2min×3;

　　2。羊血清封闭液封闭(可以加入0.3% Triton X100 )30-60min分钟;

　　3。加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g+30% Triton X100 1ml)稀释的*抗体室温反应1-2h或4℃过夜。吸去抗体，0.01MPBS洗2min×3;

　　4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育1h。吸去二抗，0.01MPBS洗2min×3;(如果是荧光二抗就可以直接用50%甘油封片，进行观察了)

　　5。加入ABC复合物，室温孵育1h，0.01MPBS洗2min×3，蒸馏水迅速冲三次;

　　6。加入硫酸镍铵溶液(DAB 25mg+蒸馏水50ml+硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml+葡萄糖200mg+氯化铵40mg+葡萄糖氧化酶1mg)，进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应;或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

　　7。梯度酒精(70%、80%、90%酒精5min×1，95%酒精5min×2，100%酒精5min×3)脱水之后，50%明胶封片。

　　1。脱片--

　　a)切片和贴片一定要过关;

　　b)冰冻切片从冰箱中拿出必须复温并凉干(室温1-2h);

　　c)清洗切片时应放在切片缸内，沿缸壁倒入PBS，静置5-10min，没有晃动的必要。

　　2。染色背景太深，而且没有阳性显色--

　　a)灌注要要过关;

　　b)需用3%双氧水甲醇溶液浸泡切片;

　　c)需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片;

　　d)延长羊血清封闭时间;

　　e)降低一抗的浓度;(我有一次就是用了较高的一抗浓度，结果没有染出东西，但是降低一抗浓度后，结果非常好，其实这就是抗体的“prozone"--前区现象)

　　3。苏木素复染

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