本文重点讲述 IHC 操作流程中的关键步骤，并提供数据以支持及解释 CST 在实验过程中所提的建议。后，本指南列出了 CST 科学家内部常用且适用于与抗体配套使用的 IHC 试剂。

抗原修复—热诱导的抗原表位修复 (HIER)

缓冲液

适用于 HIER 的缓冲液有多种。而 CST 常推荐的两种缓冲液是：pH6, 10 mM 柠檬酸盐缓冲液和 pH 8, 1 mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。一般而言，EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的 1X 溶液。

抗体：hospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb

样本：蜡包埋人类肺部肿瘤

抗原修复缓冲液：柠檬酸盐缓冲液或者 EDTA 缓冲液

煮沸装置

载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后，才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。虽然，一些研究人员也使用水浴锅，但是，因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。所以，我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到抗原修复效果。

抗体：Phospho–Stat3 (Tyr705)(D3A7) XP. Rabbit mAb

样本：石蜡包埋人类肺部肿瘤样本

煮沸设备：浴锅 ，微波炉，高压锅

免疫染色—封闭

在 IHC–P 中，我们建议在室温下在含有 Tween20 的 TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品，时长 1 小时，以防止非特异性背景染色。在进行 IHC–F 时，在含有 0.3% Triton. X–100 的 1X TBS 和 5% NGS 中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号；因此，我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。以上针对封闭步骤所提建议均是在以 SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作为检测试剂的情况下提出的。如果选择使用其他检测试剂，我们则建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。

抗体：Phospho–Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb

样本：石蜡包埋人类乳xian肿瘤

封闭：含 5% 山羊血清 (NGS) 的 TBST或者基于酪蛋白封闭剂

一抗孵育—抗体稀释液

在 IHC–P 中，有多种抗体稀释液可供选择，但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。在 CST，我们利用 SignalStain. 抗体稀释液、TBST/5% NGS（含 5% 山羊血清的 TBST）或者 PBST/5%NGS(含 5％ 山羊血清的 PBST) 来稀释一抗。因为合适的稀释剂具有抗体特异性；因此，查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。在进行 IHC–F 过程中，一抗应在封闭缓冲液 (TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS) 中稀释。

抗体：Phospho–Akt (Ser473) (D9E) XP. Rabbit mAb、Phospho–EGF

Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb

样本：石蜡包埋人类乳xian肿瘤和 HCC827 异种移植物

抗体稀释：SignalStain. 抗体稀释液或 TBST/5%NGS

检测—检测系统

传统的 IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。这种亲和素–生物素–复合物 (ABC) 系统需要进行两步法检测：包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物，然后进行显色反应。基于生物素的系统容易导致背景染色，特别是含有大量内源性生物素的肝脏、肾脏等组织。因此，我们建议使用基于聚合物的检测系统，如 SignalStain. Boost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素，而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。SignalStain. Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色，其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间，并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。

抗体：Sox2 (D6D9) XP. Rabbit mAb #3579

样本：石蜡包埋的人类肺部肿瘤

检测：基于生物素的检测或基于聚合物的检测（SignalStain. Boost IHC Detection Reagent

色原

二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中常用的色原之一。DAB 与 HRP 反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。在实验中建议始终使用高质量的 DAB 底物。在 CST 公司，IHC 小组的 CST 科学家内部鉴定 IHC 抗体所使用的都是 SignalStain. DAB 底物试剂盒。SignalStain. DAB 底物试剂盒敏感性高，且与一抗的作用效果。在 TBST 中清洗 3 x 5 分钟（若为 IHC–F，则在 TBS 中清洗 3 x 5 分钟），以清除未结合的二抗，随后将 100–400μl SignalStain. DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。一般而言，1–10 分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后，将载玻片置于蒸馏水 (dH2O) 中以阻止进一步显色。

抗体：Phospho–Stat3(Tyr705)(D3A7) XP? Rabbit mAb

样本：石蜡包埋的人类乳xian肿瘤

显色检测：利用 SignalStain? DAB Substrate Kit ，竞争者提供的 DAB