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古朵新闻| 什么是TEV蛋白酶
TEV蛋白酶是来源于烟草蚀纹病毒的nla蛋白酶中27kda的活性结构域,其氨基酸序列。tev蛋白酶具有很强的位点特异性,能够识别exxyxq(g/s)七氨基酸序列,常用序列的是glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly(或enlyfqg),其切割位点在谷氨x胺gln(p1)和甘a酸gly(p1′)之间(即p1和p1’之间),其序列专一性远比凝x酶、因子xa、肠激酶等蛋白酶高。
tev蛋白酶能够耐受范围广泛的ph(ph4-8.5)和温度(4-34℃),对一些常见的增加蛋白可溶性或稳定性的添加剂(乙二醇、egta、去垢剂以及还原剂)也都有不同程度的耐受。
有研究证明,tev蛋白酶对乙二醇、egta和一些除垢剂(tritonx-100、tween-20和np-40)不敏感,当1%chaps存在时活性降低,在低浓度变性剂(2m尿素,1%sds)和还原剂(0.7mβ-巯基乙醇)中依旧可以保持大部分活性(c.sunetal.,2012)。
野生型tev酶在表达和溶解性等方面存在一定的缺陷,所以通过基因工程技术改良的突变体有大量报道。例如,天然的tev蛋白酶会发生自我切割,在表达和纯化过程中,它会不断由于其它tev蛋白酶的碰撞而发生构象变化,在特定位点发生自我切割,从而使完整的蛋白酶被截短,活性大大降低。
lucast等人找到的s219n突变体,稳定性得到很大的提高,但是可溶性并不高,有大约95%的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中。kapust等人使用基因工程点突变了天然tev蛋白酶的基因序列,得到s219v这一稳定性较高并且酶活性也有稍微提高的突变体,其稳定性比s219n要高出约100倍。
其次,tev蛋白酶表达产量不高,溶解度也非常低。大约只有5%的tev蛋白酶存在于细胞破碎液的上清中,产量为12.5mg/l。
vandenberg等人通过基因改组(dnashuffling)、易错pcr(error-pronepcr)发现了一种可以将产量提高到54mg/l的突变体tevsh,其溶解度比s219n有很大提高,并且酶活性变化不大。cabrita,l.d.等人使用popmusic软件设计,对tev蛋白酶单点突变体进行稳定性分析,筛选出了五个突变体,它们的可溶性和酶活性相对于野生型tev蛋白酶都得到提升,同时还得到一个双突变体,其可溶性及酶活性相对于单突变体有显著提高。
针对tev蛋白酶本身的缺点,研究者一直在寻找改良的突变体。例如,tevser135gly突变体比wt更稳定,可以耐受对更高的温度(>40℃);还有一些突变(t17s,n68d,n177v)可以显著提高tev蛋白酶的溶解性。
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