古朵分析：影响ELISA双抗夹心法实验结果的七大因素

　　抗原抗体结合的特异性，酶催化反应的专一性，亲和素级联放大效应都极大地提高了双抗夹心法ELISA检测的灵敏度，对检测物的快速诊断提供了重要保证。然而，ELISA从标本制备到结果检测的任何一个步骤都影响了结果的判读。古朵生物总结如下：

　　1、样本和检抗的加样方式：

　　双抗夹心法ELISA常规检测方法是样品、抗体试剂单独加入。但有些试剂盒推荐样品和检测抗体一起加来缩减步骤从而加快检测的时间。然而由于游离的样品和检测抗体先结合后形成空间位阻效应，可能会影响样品和包被抗体的结合。所以，一般不建议将ELISA步骤中样品和检测抗体一同孵育。

　　2、孵育温度：

　　孵育温度可以选择25℃，这样可以降低检测的背景而又可以保持其在37℃下的检测灵敏度。然而在OD值整体偏低的情况，就不建议这么做了。

　　3、封闭与否：

　　牛血清白蛋白在ELISA反应中可以防止酶的分解和非特异性吸附。但是封闭并不是对所有的ELISA体系都必须。有实验表明，牛血清白蛋白封闭并不能提高ELISA体系的检测灵敏度，反而影响了低浓度样品的检测。原因可能是高浓度下的牛血清白蛋白可能会影响低浓度的标准品/样本与抗体结合，导致检测的灵敏度降低。因此，只要抗体的活性高，也可以不用封闭这一常用的步骤。

　　4、洗液中吐温浓度：

　　吐温20是阴离子表面活性剂，防止了抗原抗体的非特异性结合同时也防止后面的抗体或样品吸附到微孔板上，因此ELISA包被抗体时一定不能含有吐温20，但是包被以后的步骤中的缓冲液都可以含有吐温20，其浓度在0.05%为*。

　　5、样本严重溶血：

　　样本严重溶血红细胞破坏溶解时，释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定试验中，容易在温育过程中吸附于微孔板，从而与加入的底物反应显色，干扰测定结果，导致假阳性结果。

　　6、样本污染：

　　样本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，使检测结果出现非特异性显色。因此，ELISA检测应采集新鲜样本。

　　影响ELISA的因素还有很多，例如，酶标板的选择，包被缓冲液的种类，包被抗体的pH避免与包被缓冲液的pH相同等小细节。

　　7、边缘效应：

　　边缘效应是在使用96孔板的ELISA测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。

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