ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力实验概要

　　本实验利用ELISA检测了噬菌体抗体与目的抗原的亲和力。

　　主要试剂

　　1. 0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)

　　2. 1%BSA

　　3. HRP标记的抗M13噬菌体多抗

　　4. 2mol/L H2SO4

　　主要设备

　　1. 酶标板

　　2. 酶标仪

　　实验步骤

　　1. 将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml;

　　2. 对于要检测的每个克隆，至少包被2个孔，每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外，包被阳性对照抗原，阳性对照抗原用anti-M13抗体;

　　3. 室温包被1～2h，最好于4℃过夜包被，甩掉孔中液体，倒置于纸巾上空干。

　　4. 每孔中用至少200μl 1%BSA封闭，37℃1h。去掉液体后空干。

　　5. 将重组噬菌体事先用等体积的封闭液于室温下封闭15min～30min，以封闭各种蛋白质之间的非特异性结合位点。

　　以M13噬菌体作为阳性对照噬菌体，也按上述步骤操作。

　　6. 在每个包被抗原孔中，加入稀释的重组噬菌体悬液200μl，37℃ 1～2h。在包被了阳性对照抗原的孔中，加入200μl阳性对照噬菌体。

　　7. 去掉孔中液体，倒置于纸巾上。将板浸入PBS/0.5% Tween20(PBST)中，振荡赶走气泡，将板取出。重复洗涤5遍。

　　8. 将板倒置于纸巾上，去掉所有液体。

　　9. 将HRP酶标的Anti-M13抗体用封闭缓冲液稀释至合适浓度。

　　10. 在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀释液。

　　11. 37℃温育1h。按前述方法洗涤6次。

　　12. 每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30% H2O2。在每孔中加入200μl。

　　13. 置室温20～60min，直至出现适中的颜色反应。加入2mol/L H2SO4终止反应。

　　14. 于415nm波长下用酶标仪读出光吸收值。良好的数据中，噬菌体抗体与筛选抗原的吸收值应当比阴性对照抗原的吸收值高2～3倍。

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