间接ELISA中试剂的配制及反应流程实验概要

　　间接ELISA是一种很实用而常用的免疫分析方法，本文将对反应中所用到的试剂的配制方法和反应的流程进行阐述。

　　主要试剂

　　1. 包被缓冲液：(0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液)

　　Na2CO3 1.59g

　　NaHCO3 2.93g

　　蒸馏水 1000ml

　　4℃保存，一周内用完。

　　2. 磷酸盐缓冲液(PBS，PH 7.4)

　　NaCl 8.0g

　　KH2PO4 0.2g

　　KCl 0.2g

　　Na2HPO4.12H2O 3.65g

　　蒸馏水 1000ml

　　3. 洗涤液(0.01 mol/L，pH7.4的PBST)

　　1L PBS中加入0.5ml Tween-20

　　4. 封闭液(5% 脱脂奶粉)

　　5g 脱脂奶粉加入100ml PBS缓冲液中。

　　5. 一抗及二抗稀释液(2% 脱脂奶粉)

　　2g 脱脂奶粉加入100ml PBS缓冲液中。

　　6. 配制显色液所需试剂：

　　1) 0.1M 柠檬酸(1.05g柠檬酸 50ml双蒸水)

　　2) 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.1628g Na2HPO4.12H2O 100 ml双蒸水)

　　3) 1% TMB (10mgTMB 200μl无水乙醇 800μl水)

　　这三种溶液均须现用现配。

　　7. 显色液：

　　分别取A液 24.3ml，B液25.7ml，混合后加入50ml 双蒸水。然后从中取出9.9ml移入新试管中，再加入100μl C液，最后加入10μl 30% H2O2。

　　注意：30% H2O2溶液应避光保存。C液和H2O2溶液最好在临用前加入。

　　8. 终止液(2M的H2SO4)

　　11 ml浓硫酸 89ml水

　　实验步骤

　　1. 包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度(如2μg/ml)，每孔加入100μl稀释好的抗原，于4℃下过夜。

　　2. 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟。洗涤时将板子放在96孔板振荡器上，600转/分钟。

　　3. 封闭：每孔加入300μl封闭液，放于湿盒中，37℃，孵育2h。注意要将湿盒提前放入37℃温箱中预热。

　　4. 洗涤：同步骤2。

　　5. 加一抗，即被检血清：每孔加入用一抗稀释液稀释好的被检血清100μl，放于湿盒中，37℃，孵育1h。注意设置阳性和阴性对照。

　　6. 洗涤：洗涤方式同步骤2，次数为4次。

　　7. 加酶标二抗：按商品化酶标二抗的推荐浓度或者预实验中较好的浓度稀释二抗，每孔加100μl，放于湿盒中，37℃，孵育1h。

　　8. 洗涤：同步骤6。

　　9. 加显色液：每孔加100μl显色液，避光反应15分钟。

　　10. 终止：每孔加入50μl终止液。

　　11. 读数：将ELISA反应板放入酶标仪中，读取OD值。注意酶标仪应提前15分钟打开预热，还有读数前最好用酒精棉球擦拭反应板底部，以除去指痕等污渍。

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