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【古朵生物】elisa检测中二抗时间延长会造成什么影响
二抗孵育
参考二抗的说明书,按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗。
吸尽洗涤液后,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1~2小时。回收二抗。然后加入Western洗涤液,在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅,所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合,减少背景。同时短时间多次的洗膜比长时间少次数的洗膜更有效。
第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween-20,因为它可以阻碍底物的沉积。
注意事项
1) 抗体保存注意事项:
2)收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存!
3)对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃ .
4)分装的量以一次实验用完为好,最少不能少于10 ul每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
5)复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在40℃,避免再冻起来!
6)绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。
7)大部分抗体收到后40℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
8)长期保存,加入叠氮纳,防止细菌污染。
一抗/二抗使用问题:
一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择的比例,一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间,洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;还要注意一抗二抗的匹配。
天然和非还原样品问题:
有些抗体只能识别的表位是非连续氨基酸,这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续,但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态。对于这些样品,缓冲液和凝胶中就不能含有SDS,并且不能够对蛋白进行加热变性。
Elisa试剂盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品,励志研发和销售的综合性生物公司,产品远销多个国家和地区,我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向,不断开发高质量的新产品,提供客户满意的综合服务质量"的方针。