ELISA双抗体夹心法操作步骤：

　　(1)包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。

　　(2)加样：加一定浓度稀释的待检样品(同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。

　　(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度) 0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。

　　(4)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。

　　(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。

　　(6)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm (若ABTS 显色，读410 nm)，读数，输出到Excel 中。

　　(7)以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。

　　双抗夹心法分双抗体夹心测抗原和双抗原夹心测抗体，方法都是类似的。就以双抗体夹心测抗原为例吧 大概步骤如下 ：

　　1、将异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

　　2、加待检标本，保温反应，洗涤除去未结合物质。

　　3、加酶标抗体，保温反应，洗涤除去未结合物质。

　　4、加底物显色。

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