多重荧光免疫组化染色试剂盒(组合系列)

　　组织微环境中有复杂的细胞组成，这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，常规IHC检测只能展示单一指标，难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系，而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要!

　　酪氨信号放大技术原理：类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生产活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨s共价结合，使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体，在换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

　　应用主要用于人源或小鼠组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。

　　使用方法样本要求：

　　1. 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。

　　2. 玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。

　　3. 组织最小应包含大于1000 个细胞。

　　4. 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。

　　5. 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18～24 小时。

　　6. 切片厚度为4um 左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。

　　7. 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴。

　　8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，确保水分去除、贴片牢固。

　　试剂准备：

　　1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)

　　2) 抗原修复液：根据一抗选择柠檬酸钠或者EDTA修复液

　　3) 抗体稀释液：可做抗体稀释和封闭使用，即用型

　　4) 一抗工作液：现用现配，根据预实验条件优化浓度

　　5) 二抗工作液：二抗工作液为HRP-羊抗鼠兔或兔双抗

　　6) 荧光染料染色工作液：系列单色荧光染料为200X 母液，使用前用TSA 信号放大反应液1:

　　200 稀释用配好的工作液4℃保存，仅限当天使用。

　　7) DAPI 工作液：DAPI 使用无菌水按1：100稀释制备工作液

　　操作步骤：建议采用实验操作表格进行记录

　　1. 样品脱蜡准备：

　　a) 温箱设置到55℃-60℃，烤片1h 以上。

　　b) 新鲜二甲苯浸片10min，重复3 次。

　　c) 梯度乙醇浸片：100% 3min;95% 3min;70% 3min。

　　d) 灭菌水洗片1min，重复3 次。

　　2. 多重荧光免疫组化染色步骤(A、B、C 三种抗体为例) ：

　　A 抗体

　　A.1 抗原修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min 煮沸，立刻放入切片，低火(约20%功率) 继续加热15min 后冷却至室温。进行该步骤之前建议不放样品进行一次预实验，检测15min 后液面是否高于样品，避免干片，抗原修复液不能2 次使用。

　　A.2 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。

　　A.3 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释A 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　A.4 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　A.5 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　A.6 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火(约20%功率)继续加热10min 后冷却至室温。

　　B 抗体

　　B.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。

　　B.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释B 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　B.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　B.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　B.5 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火(约20%功率) 继续加热10min 后冷却至室温。

　　C 抗体

　　C.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。

　　C.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释C 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　C.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　C.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。

　　C.5 微波修复：把1X 碱性抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火(约20%功率) 继续加热10min 后冷却至室温。

　　每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST 覆盖样品，防止干片。

　　3. DAPI 复染及封片：

　　去除玻片上残存洗液，滴加DAPI 工作液，室温孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分钟，用灭菌水洗片2 分钟， 在样品上滴加适量抗淬灭封片剂，加盖玻片，小心排除气泡，用透明指甲油封住盖玻片四周，室温晾干，4℃ 避光保存。

　　4. 成像：

　　选用成像设备按照染料光谱条件设置拍摄条件，对染色后的组织片在荧光显微镜下数据并进行

　　判读分析。

　　多重荧光免疫组化染色试剂盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。古朵试剂盒