实验分享：石蜡切片免疫组化染色步骤

　　1、载玻片的处理：

　　抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。古朵技术总结具体方法如下：

　　1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

　　1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

　　1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

　　2、常用酶消化：

　　2.1 胰蛋白m：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

　　2.2 胃蛋白m：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin(层粘蛋白)，Collagen IV(IV型胶原)等。

　　2.3 皂素(Saponin)：一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。

　　3、抗原热修复：

　　可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

　　3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器，室温冷却10~20分钟(注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

　　3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后)，计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

　　3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

　　4、免疫组化染色步骤：

　　(以美国ZYMED公司SP试剂盒为例)

　　4.1石蜡切片脱蜡至水。

　　4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

　　4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

　　4.4 5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

　　4.5 PBS冲洗，5分钟×3次。

　　4.6滴加适当比例稀释的生物s标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物s标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

　　4.7 PBS冲洗，5分钟×3次。

　　4.8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

　　4.9 PBS冲洗，5分钟×3次。

　　4.10显色剂显色(DAB或AEC)。

　　4.11自来水充分冲洗，复染，封片。

　　冰冻切片免疫组化染色步骤

　　冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。

　　石蜡切片免疫组化染色步骤上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。古朵试剂盒